< Back to previous page

Publication

Genetic variability in genes involved in pattern recognition and epithelial barrier integrity and their role in susceptibility to inflammatory bowel disease and immune-mediated disorders

Book - Dissertation

De ziekte van Crohn (CD) en colitis ulcerosa (UC) zijn de twee belangrijkste inflammatoire darmziekten (IBD). CD en UC zijn chronische recidiverende aandoeningen van colon en/of ileum, gekenmerkt door opstoten met (bloederige) diarree en abdominale pijn, afgewisseld met perioden van remissie. De prevalentie van IBD in Noord-Europa en Amerika is om en bij de 200à300 per 100 000, met een incidentie die blijft toenemen. Ondanks belangrijke inspanningen om de pathogenese van IBD the ontsluieren blijft de exacte oorzaak van CD en UC onbekend. Globaal is men het er wel over eens dat IBD het gevolg is van een onaangepaste immuunrespons die optreedt in een genetisch voorbeschikte persoon als gevolg van een complexe interactie tussen omgevingsfactoren, microbiële factoren en het immuunsysteem van de darm.Met deze verhandeling wilden we een beter zicht krijgen op de rol van varianten in genen betrokken bij patroonherkenning en integriteit van de epitheliale barrière in het ontstaan en de evolutie van IBD, en in de oorzaak van een van de extraintestinale manifestaties van IBD, primair scleroserende cholangitis (PSC). Gezien het aangeboren immuunsysteem een belangrijke rol speelt in herkenning van, tolerantie voor en verdediging tegen bacteriën, wilden we daarnaast ook de mogelijke invloed ven deze genen op het ontstaan van antimicrobiële seroreactiviteit bij IBD patiënten bestuderen. Zowel een slecht functionerend immuunsysteem als een defecte epitheliale barrière worden ook in verband gebracht met bacteriële translocatie en het ontstaan van een inadequate systemische inflammatoire respons en ernstige infecties bij kritiek zieke patiënten; daarom wilden we nakijken of genen van het aangeboren immuunsysteem een rol spelen in het infectierisico bij patiënten die opgenomen worden op een medische intensieve zorgeenheid. Ten slotte wilden we nagaan of onze bevindingen een toepassing kennen in de klinische praktijk. Een eerste deel van deze verhandeling beschrijft kandidaatsgenonderzoek bij patiënten met PSC. We onderzochten respectievelijk de CC-type chemokine receptor 5 delta 32 mutatie, varianten in het RANTES gen en mutaties in het cystic fibrosis transmembrane regulator (CFTR) gen.Het gen voor de CC-chemokine receptor 5 (CCR5) ligt op chromosoom 3p21 en codeert voor een G-proteïne gekoppelde transmembranaire receptor, die reeds uitgebreid bestudeerd werd voor zijn rol als co-receptor voor de opname van HIV-1 in CD4+ T-cellen. Een deletie van 32 baseparen (Δ32) in dit gen leidt tot een frame shift en een premature beëindiging van het proteïne, en verminderde expressie van de receptor op het celoppervlak. Heterozygositeit voor CCR5Δ32 beschermt tegen internalisatie van pathogenen zoals HIV-1 en andere intracellulaire organismen. De CCR5Δ32 variant lijkt ook een rol te spelen in de pathofysiologie van een aantal (auto)inflammatoire ziekten (vb. multiple sclerose, reumatoïde arthritis, diabetes mellitus type 1, transplantnier-overleving). Onze hypothese was dat deze functionele variant een protectieve rol zou kunnen spelen tegen het ontstaan en de evolutie van PSC. We vonden dat de CCR5Δ32 allelefrequentie significant lager was bij PSC patiënten in vergelijking met gezonde controles en IBD patiënten. Opmerkelijk was dat geen van de patiënten met ernstige progressieve PSC en nood aan een levertransplantatie dit allel droeg. Verminderde expressie van de CCR5 receptor lijkt te beschermen tegen PSC, mogelijk door verminderde chemotaxis van geheugen T-cellen naar het hepatische endotheel, of door verminderde internalisatie van intracellulaire pathogenen.Daarna onderzochten we de rol van één van de liganden van de CCR5-receptor, namelijk RANTES (Regulated on Activation Normal T Expressed and Secreted; ook CC-motif chemokine ligand 5 of CCL5 genoemd). Het RANTES gen is een aanvaardbaar kandidaatsgen voor PSC omwille van zijn pro-inflammatoire eigenschappen zowel als ligand als onafhankelijk van CCR5. Het -28G polymorfisme in de promotor regio van RANTES leidt tot een toegenomen transcriptie van het gen, en werd significant méér gevonden bij PSC patiënten dan bij IBD patiënten en gezonde controles. Toegenomen expressie van RANTES, met een onaangepaste inflammatoire reactie in de darm tot gevolg, zou kunnen voorbeschikken tot bacteriële translocatie en vervolgens beschadiging van de galwegen.Klinische, histologische en radiologische kenmerken van PSC kunnen erg lijken op de afwijkingen die gezien worden in de lever van patiënten met mucoviscidose (cystic fibrosis, CF), een aandoening die veroorzaakt wordt door mutaties in het CFTR gen, en cftr -/- knock-out muizen ontwikkelen belangrijker galwegschade na inductie van colitis dan cftr +/+ wild type muizen. Daarom lijkt het CFTR gen ook een interessant kandidaatsgen voor PSC. Het gen was al in meerdere kleine studies bestudeerd, met tegenstrijdige resultaten. We onderzochten de rol van CFTR varianten op het ontstaan en de evolutie van PSC in onze populatie van PSC patiënten. Uit onze resultaten blijkt dat varianten die geassocieerd zijn met minder of niet functionerend CFTR (1540G and TG11-TG7) zouden kunnen beschermen tegen de ontwikkeling van PSC. Het is niet duidelijk of deze resultaten enkel en alleen kunnen worden verklaard door het effect van de bestudeerde varianten op de kanaalfunctie van CFTR, of dat deze varianten ook een invloed hebben op de functie van CFTR als regulator van intracellulaire processen of als patroonherkenningreceptor. In het serum van patiënten met IBD worden antistoffen tegen verschillende microbiële epitopen aangetroffen. In een volgende studie onderzochten we daarom het verband tussen genen voor patroonherkenningsreceptoren en de ontwikkeling van deze antistoffen bij patiënten met CD en UC. We vonden een significante associatie tussen varianten in deze genen en het ontstaan van antimicrobiële antistoffen. Eerst en vooral konden we de gekende associatie tussen NOD2/CARD15 varianten en anti-Saccharomyces cerevisiae (ASCA) antistoffen bevestigen, een verband dat onafhankelijk bleek van de gekende associatie van zowel ASCA als CARD15 met ileale aantasting en gecompliceerde ziekte. De drie bestudeerde CARD15 varianten (R702W, G908R and L1007fsinsC) leiden tot een tekortschietende herkenning van bacterieel muramyl dipeptide, verminderde NF‑kappa B activatie, abnormale intestinale permeabiliteit en een verminderde expressie van bepaalde antimicrobiële peptiden (vb. defensines). Al deze factoren kunnen bijdragen tot een toegenomen bacteriële translocatie en daarop volgende antistofrespons tegen microbiële componenten. Ook varianten in het NOD1/CARD4 gen waren geassocieerd met gASCA positiviteit en aantasting van het colon bij CD patiënten. Bij UC patiënten bleken NOD1/CARD4 varianten geassocieerd met verminderde Omp positiviteit. De TLR4 D299G variant was bij CD patiënten geassocieerd met verminderd aantal positieve antistoffen bij Crohn patiënten en een verminderde kans op Omp positiviteit bij UC patiënten. Deze bevindingen suggereren een belangrijke rol voor de leucin rich repeat (LRR) regio in het ontstaan van antimicrobiële seroreactiviteit. Het is niet duidelijk waarom mutaties in de LRR region van CARDs en TLRs een tegengesteld effect lijken te hebben, maar mogelijk is het verschil in cellulaire positie (aan het celoppervlak voor TLRs en intracellulair voor de CARDs) een (deel van de) verklaring. Gezien het belang van de bacteriële flora en de epitheliale barrière in de pathogenese van septische complicaties, bestudeerden we vervolgens de invloed van genetische factoren op het ontstaan van bloedstroominfectie en mortaliteit bij patiënten opgenomen op een intensieve zorgafdeling (ICU). We selecteerden hiertoe een aantal polymorfismen in genen van het aangeboren immuunsysteem. De combinatie van een variant in twee patroonherkenningsreceptorgenen, NOD2 en TLR4, aangetroffen in 5% van de populatie, maakte patiënten vatbaar voor het snel ontwikkelen van bacteriëmie tijdens hun verblijf op ICU, en verhoogde het risico op relatief laattijdige mortaliteit. Deze gegevens lijken erop te wijzen dat in de aanwezigheid van deze varianten in NOD2 en TLR4 bacteriën makkelijker worden opgenomen in de bloedstroom, wat een ernstige verzwakking van de initiële antibacteriële respons suggereert. Dat het effect van een combinatie van varianten in NOD2 en TLR4 groter is dan voor elke variant afzonderlijk kan worden verklaard door het gekende synergisme tussen de respons op muramyl dipeptide/peptidoglycan en lipopolysaccharide. De complexiteit van het mechanisme van vatbaarheid en respons op infectie wordt hierdoor nogmaals benadrukt. Ook de aanwezigheid van mutaties in het MASP2 gen, aanwezig in 9% van de populatie, was een voorbeschikkende factor voor mortaliteit. Beide bestudeerde MASP2 mutaties zijn geassocieerd met MASP2 deficiëntie. MASP2 vormt complexen met MBL, maar ook met 2 andere complement-activerende oplosbare patroonherkenningsreceptoren, H-ficolin en L-ficolin. Deficiëntie van MASP2 inhibeert dus de complementactivatie via deze 3 moleculen, wat kan verklaren waarom het effect van de MASP2 alleles in deze cohorte zo uitgesproken is. We besluiten dat functionele varianten in genen van het aangeboren immuunsysteem geassocieerd zijn met vatbaarheid voor ernstige infecties en mortaliteit in kritiek zieke patiënten, deels door een effect van deze varianten op witte bloedcelfunctie. Op termijn zou op basis van deze varianten en bepaalde klinische factoren een risico model kunnen worden ontworpen, op basis waarvan hoogrisico patiënten geïdentificeerd kunnen worden, waarbij specifieke preventieve of therapeutische interventies (vb. vaccinatie, antibioticaprofylaxis, selectieve darmdecontaminatie, MASP2 supplementatie) van toepassing kunnen zijn In een laatste studie onderzochten we de rol van recent ontdekte susceptibiliteitsgenen op het ziektegedrag en het optreden van complicaties bij patiënten met de ziekte van Crohn. Ons doel was om patiënten met een hoog risico voor progressieve ziekte vroegtijdig op te sporen, omdat dit therapeutische implicaties zou kunnen hebben. Hiertoe wilden we een risicomodel ontwikkelen waarbij genetische en klinische karakteristieken bij diagnose geïntegreerd worden. Kaplan-Meier survival analyses, multipele logistische regressie en gegeneraliseerde multifactor-dimensionaliteitsreductie analyses (GMDR) warden uitgevoerd, gecorrigeerd voor follow-up tijd. De rs1363670 C-allele, gelokaliseerd in een gen coderend voor een hypothetisch proteïne, gelegen in de buurt van het IL12B gen, was geassocieerd met snelle evolutie naar het ontstaan van stricturen. Grondig sequeneren van de regio waarin deze variant ligt is echter nodig om uit te zoeken wat de exacte functie ervan is, en welk polymorfisme precies de associatie verklaart. Ook het beste GMDR interactiemodel voor stenoserende ziekte groepeert enkele interessante kandidaten, die verder moeten worden onderzocht. Rs12704036, gelegen in een zogenaamde gen-woestijn, bleek de beste genetische predictor voor het ontstaan van niet-perianale fistels, zowel in een multipel logistisch regressiemodel als in het GMDR interactiemodel. Alle analyses wijzen op een belangrijke rol voor CARD15 in protectie tegen perianale fistels. De resultaten van deze studie bevestigen onze hypothese dat genetische varianten een rol spleen in de vatbaarheid voor sommige complicaties bij Crohn-patiënten, en dat ze kunnen helpen bij risicostratificatie van patiënten bij diagnose. Het bestuderen van genetische varianten is uiteraard slechts een vertrekpunt voor verder onderzoek. We hopen dat de resultaten die in deze verhandeling worden beschreven hebben bijgedragen tot het begrijpen van de onderliggende moleculaire mechanismen van ziekte, en dat ze uiteindelijk zullen helpen bij het implementeren van bevindingen uit genetische studies in de klinische praktijk.
Accessibility:Closed