< Terug naar vorige pagina

Project

Cryopreservation van genotypes bij Daphnia magna.

De watervlo Daphnia magna is een belangrijk modelorganisme in verscheidene onderzoeksdomeinen, zoals ondermeer ecologie, ecotoxicologie en evolutionaire biologie en de meeste van deze toepassingen maken gebruik van clonale lijnen geproduceerd via aseksuele reproductie. Tot op heden worden deze lijnen bijgehouden door ze continu in cultuur te houden. Dit is niet alleen arbeidsintensief, het is ook niet geheel zonder risico. Clones kunnen gecontamineerd worden of verloren gaan door ziekte of accidenteel verlies. Om dit probleem op te lossen hebben we tijdens dit doctoraatsonderzoek geprobeerd om een cryopreservatieprotocol te ontwikkelen voor de aseksuele eieren van Daphnia magna.

De dormante eieren van de watervlo, geproduceerd via seskuele reproductie, zijn wel droogte- en vriesresistent en kunnen daarom fungeren als referentiemateriaal. In een eerste deel hebben we dan ook de biochemische verschillen tussen beide eitypes bepaald. Onze resultaten toonden aan dat aseksuele eieren in het totaal meer vetzuren bevatten, maar seksuele eieren bevatten altijd een bepaalde concentratie aan lange ongesatureerde vetzuren, vooral EPA en ARA, ook als deze niet worden aangerijkt door het voedsel. De samenstelling van de suikers was zeer verschillend in seksuele en aseksuele eieren. Seksuele eieren bevatten zeer hoge concentraties aan trehalose (4.15% van hun drooggewicht), terwijl aseksuele eieren maar 0.006% bevatten. Ook de samenstelling van de polyamines vertoonde opvallende verschillen tussen beide types eieren. Aseksuele eieren bevatten meer van de metaboliet diaminopropaan en lagere hoeveelheden van spermidine en putrescine dan seksuele eieren.

In een tweede stap hebben we geprobeerd om de samenstelling van de aseksuele eieren te wijzigen opdat ze meer resistant zouden worden. Vetzuursamenstelling van de eieren wordt sterk beïnvloed door het maternale dieet, dus om de hoeveelheid meervoudig ongesatureerde vetzuren te verhogen hebben we de vrouwelijke Daphnia gevoederd met een dieet dat veel meervoudig ongesatureerde vetzuren bevat. Daarnaast wordt de vetzuursamenstelling van aseksuele eieren ook sterk beïnvloed door de temperatuur waarop de vrouwtjes worden gekweekt, deze alloceren meer meervoudig ongesatureerde vetzuren naar hun eieren wanneer ze gekweekt worden op koude temperaturen. Vervolgens hebben we geprobeerd om het gehalte aan trehalose in aseksuele eieren te verhogen door het maternale dieet te supplementeren met trehalose bevattende liposomen, maar dit reflecteerde slechts in een zeer kleine stijging.

In parallel met voorgaande stappen, hebben we ook het cryopreservatieprotocol geoptimaliseerd. Om voldoende uitdroging van de eieren te bekomen hebben we gekozen voor een voorbehandeling bestaande uit 2 stappen vooraleer de eieren werden ingevroren via ‘droplet vitrificatie’. Deze voorbehandeling bestaat uit het laden van gelycerol via de blootstelling aan een glyceroloplossing van 10% gedurende 30 min gevolgd door osmotische dehydratatie in een vitrificatieoplossing. De vitrificatieoplossing resulterend in de hoogste overleving, na blootstelling eraan voor 10 of 20 min, bevat 10% glycerol, 30% methanol en 0.5M trehalose.

In de laatste stap, combineerden we de procedure voor het wijzigen van de samenstelling van de asksuele eieren met het meest geschikte cryopreservatieprotocol. Deze stapsgewijze aanpak resulteerde in succesvolle cryopreservatie van asksuele eieren van Daphnia magna. Ondanks het feit dat de ontluikingspercentages nog zeer laag zijn, is dit een grote stap voorwaarts in het proces naar het veilig bewaren van clonale lijnen.

 

 

Datum:1 jan 2011 →  21 aug 2015
Trefwoorden:Cryopreservation, Daphnia magna, Asexual reproduction, Vitrification
Disciplines:Dierkundige biologie, Geologie, Aquatische wetenschappen, uitdagingen en vervuiling, Visserij
Project type:PhD project