Platform ontwikkeling voor de combinatie van fluorescente en elektrische detectie van enkelvoudige moleculen met een applicatie in DNA mapping.

Doorheen de hele geschiedenis heeft de mensheid naar middelen gezocht om onze omgeving beter te kunnen beheersen en te begrijpen. Hiervoor hebben we onze natuurlijke zintuigen uitgebreid met een reeks van sensoren. Dit zijn werktuigen die ons toelaten om zowel het hele grote, zoals de samenvoeging van twee zwarte gaten zo’n 1.3 miljard lichtjaren verwijderd van de aarde, als het hele kleine, zoals het identificeren van een enkel viraal partikel in een oceaan van moleculen, te detecteren. Deze thesis is gewijd aan de studie van de natuurkundige werkingsprincipes van een erg kleine, maar veelzijdige sensor: de biologische nanoporie (BNP). BNPs zijn eiwitten die in staat zijn om openingen ter grootte van enkele nanometers, te vormen in een lipide dubbellaag. Telkens wanneer er een molecule zich doorheen deze opening beweegt (‘translokeert’), onthult de tijdelijke storing van de ionische stroom kostbare informatie omtrent de identiteit en de eigenschappen van het translokerende molecule. Ondanks die voor de hand liggende detectiemethode, maakt de complexiteit van de interacties tussen de nanoporie en het translokerende molecule het erg moeilijk om de veranderingen in de ionische stroom één-op-één te verbinden met hun feitelijke, natuurkundige oorzaak. Omdat computationele methoden, zoals degene beschreven in deze thesis, bijna alle aspecten van het detectieproces kunnen modelleren met atomaire precisie, kunnen ze een belangrijke bijdrage leveren ter oplossing van dit probleem. Naast het oplijsten van nodige concepten en de huidige stand van zaken in het nanoporie onderzoeksveld (hoofdstuk 1), zijn er vier hoofddoelstellingen in deze thesis:

1. De ontwikkeling van methodes voor het accuraat modelleren van BNPs;

2. Het onderzoeken van de evenwichtselektrostatica van BNPs;

3. Het verklaren van het gedrag van een eiwit dat gevangen zit in een BNP;

4. Het in kaart brengen van de transporteigenschappen van een BNP.

In het eerste deel van deze thesis (hoofdstuk 3) hebben we gebruik gemaakt van 3D evenwichtssimulaties, gebaseerd op numerische oplossingen van de Poisson-Boltzmann vergelijking, om de elektrostatische eigenschappen van de pleurotolysin AB (PlyAB), de cytolysin A (ClyA) en de fragaceatoxin C (FraC) nanoporiën te onderzoeken. In het bijzonder hebben we aangetoond dat het aanbrengen van enkele (of zelfs één enkele) mutaties die de lading van het aminozuur omwisselen, een grote elektrostatische impact kunnen hebben, resulterende in een erg verminderende of zelfs omgekeerde elektro-osmotische stroming. Bovendien hebben onze simulaties aangetoond dat het verlagen van de pH de invloed van de negatief geladen aminozuren sterk onderdrukt, terwijl het die van de positief geladen groepen onaangeroerd laat. Om uit te zoeken in welke mate de FraC en ClyA poriën in staat zijn om DNA te translokeren, hebben we de elektrostatisch gebaseerde energetische kost berekend die gepaard gaat met de translokatie van enkelstrengig en dubbelstrengig DNA. Hieruit bleek dat de exacte positionering van positieve ladingen in staat is om de translokatie toe te laten, door ofwel de hoogte van de energetische barrière fel te doen afnemen, of door de DNA streng diep genoeg in de porie te doen binnendringen zodat deze de kracht heeft om de barrière te overwinnen. Hoewel de simulaties in dit hoofstuk aantonen dat het afleiden van enkele primaire karakteristieken van biologische nanoporiën mogelijk is met evenwichtselektrostatica, maken ze ook duidelijk dat de toevoeging van niet-evenwichtskrachten essentieel is voor de ontwikkeling van een volledig inzicht.

In het volgende hoofdstuk (hoofdstuk 4) onderzoeken we de immobilisatie van een enkel eiwit binnen in een nanoporie, welke van belang is voor toepassingen zoals de studie van enkelvoudige enzymes. Hiervoor hebben we een studie uitgevoerd van de gemiddelde verblijfstijd van dihydrofolaatreductase (DHFRtag ), een klein eiwit aan wiens C-terminus een positief geladen polypeptide werd vastgemaakt, in ClyA. Meer concreet zijn we erin geslaagd om, door het manipuleren van de ladingsverdeling, de verblijfstijd met enkele grootteordes te verhogen. Verder hebben we ook een analytisch transportmodel opgesteld, gebaseerd op het overbruggen van de sterische, elektrostatische en elektro-osmotische energetische barrières aan beide uiteinden van de porie, om de ontsnapping van DHFR tag uit ClyA te modelleren. Een systematische studie van de verblijfstijden in functie van de aangelegde potentiaal, samen met een uitgebreide set van evenwichtselektrostatica simulaties, liet ons toe om dit dubbele-barrière model te parametriseren. Dit legde op zijn beurt dan weer enkele eigenschappen bloot die moeilijk experimenteel te bepalen zijn, zoals de translokatie kansen en de kracht die uitgeoefend wordt op het eiwit door de elektro-osmotische stroming van ClyA (≈9pN bij −50mV). De relatieve eenvoud van het dubbele-barrière model en het feit dat het geen expliciete parameters bevat omtrent de geometrie van DHFRtag, suggereren dat deze aanpak ook voor andere kleine eiwitten van toepassing kan zijn.

In de finale hoofstukken hebben we een nieuw continuüm kader ontwikkeld omtrent de modellering van BNPs onderhevig aan niet-evenwichtscondities (hoofdstuk 5), die we vervolgens toegepast hebben op de ClyA nanoporie (hoofdstuk 6). Hoewel ze vaak kwalitatief nuttige resultaten genereren, is de capaciteit van continuümmodellen om transportproblemen op nanometerschaal kwantitatief op te lossen eerder gelimiteerd. Daarom hebben we de “extended Poisson-Nernst-Planck-Navier-Stokes (ePNP-NS)” vergelijkingen ontwikkeld, welke op zelf-consistente wijze de eindige grootte van de ionen in rekening brengen, alsook de invloed van zowel de ionische sterkte als de nanoscopische schaal van de porie op de lokale eigenschappen van het elektrolyt. Door de ePNP-NS vergelijkingen numerisch op te lossen voor een computationeel efficiënt model van ClyA, waren we in staat om de nanofluidische karakteristieken van de porie voor een brede waaier aan experimenteel relevante potentialen en zout concentraties in kaart te brengen. Hierbij kwamen we tot de vaststelling dat de gesimuleerde ionisch conductiviteiten nagenoeg identiek waren aan de experimenteel gemeten waardes. Dit getuigt van een natuurkundig nauwkeurig model. Om deze reden hebben we onze simulaties dan ook gebruikt om gedetailleerde inzichten te verwerven omtrent de ware ionselectiviteit, de verdeling van de ion concentraties, het landschap van de elektrostatische potentiaal, de sterkte van de elektro-osmotische stroming en de interne drukverdeling. Zoals ze nu zijn, kunnen de ePNP-NS vergelijkingen al fundamenteel nieuwe inzichten verschaffen omtrent de nanofluidische eigenschappen van BNPs, en maken ze ook de weg vrij naar het rationeel modificeren van zulke poriën.

In deze thesis hebben we aangetoond dat simulaties, in combinatie met systematische experimenten, gebruikt kunnen worden als computationele ‘microscopen’, die ingezet kunnen worden om de natuurkundige fenomenen te onderzoeken die aan de basis liggen van nanoporie-gebaseerde sensoren. Eenvoudige evenwichtselektrostatica berekeningen zijn reeds erg leerrijk gebleken. Desondanks is het duidelijk dat de complexe interacties tussen de nanoporie en het translokerende analyt molecule een niet-evenwichtsaanpak vereist die zowel rigoureus als zelf-consistent is, zoals de ePNP-NS vergelijkingen. Verdere verbeteringen zouden dit simulatiekader van een ‘na-de-feiten’ analysemethode kunnen promoveren tot een krachtig ontwerpmiddel. Dit zou nanoporieonderzoekers in staat stellen om automatisch de eigenschappen van nieuwe nanoporiën in kaart te brengen, of om het ionische signaal van het eender welk molecule te voorspellen