< Terug naar vorige pagina
Project
Pseudomonas aeruginosa / bacteriofaag interactoomanalyse: Identificatie van nieuwe bacteriële doelwitten en antimicrobiële molecules.
Pseudomonas aeruginosa</> is een veelvoorkomende pathogeen die levensbedreigende infecties veroorzaakt. Gezien de huidige trend in de ontwikkeling van nieuwe antibioticumklassen, zullen er binnenkort geen effectieve behandelingen meer voorhanden zijn. Hierdoor is er een dringende noodzaak om innovatieve antibiotica te ontwikkelen die volledig nieuwe essentiële bacteriële
reactiewegen aanpakken.
Lytische (bacterio)fagen, de natuurlijke vijand van bacteriën, zijn volledig afhankelijk vanhet bacteriële metabolisme van hun gastheer voor hun vermenigvuldiging.Gedurende miljoenen jaren coëvolutie hebben fagen een grote diversiteitaan eiwitten ontwikkeld die specifieke bacteriële processen inhiberen of omvormen in hun eigen voordeel. Een heel aantal van dergelijke interacties leiden tot een tijdelijke groeistop of zelfs het afdoden van de gastheer. Gebaseerd op deze observatie zou het exploreren van alle beschikbare faaggenomen en de hierop gecodeerde eiwitten een nieuwe bron kunnen zijn van antibacteriële middelen.
In dit werk werd vertrokken vaneen selectie van 158 vroege faageiwitten van negen verschillende
bacteriofagen van P. aeruginosa</>. Vervolgens werd op zoek gegaan naar groei-inhibitorische faageiwitten, gezien deze de grootste kans hebben te interageren met essentiële doelwitten in hun gastheer. Door de eiwitten individueel tot expressie te brengen in P. aeruginosa</> PAO1 werden negentien verschillende onbekende faageiwitten met antibacteriële activiteit
geïdentificeerd.
Om hun werkingsmechanisme te bestuderen, werd voor elk van de antibacteriële faageiwitten een systematische yeast two-hybrid eiwit-eiwitinteractieanalyse uitgevoerdtegen een willekeurige genomische fragmentenbank van P. aeruginosa</> PAO1. Hieruit bleek dat fagen het gastheermetabolisme op zeer veel verschillende manieren beïnvloeden.
Een mooi voorbeeld is LUZ24gp4. Voor dit faageiwit werd als potentiële interactiepartner in P. aeruginosa</> transcriptiefactor MvaT geïdentificeerd, wat ook bevestigd werd in vitro door coprecipitatie. MvaT is een histon-achtig eiwit, dat door de vorming van oligomeren een cruciale rol heeft in het compact houden van het bacteriële chromosoom. Bovendien laat polymerisatie van het eiwit en binding aan AT-rijk DNA het stilleggen van de expressie van bepaalde genen, gelegen op het AT-rijke DNA, toe. Hierdoor worden mogelijke negatieve effecten van niet-eigen DNA, dat meestal AT-rijk is, tot een minimum herleid. Gel shift experimenten met recombinant aangemaaktMvaT en LUZ24 gp4 bevestigden de inhibitie van MvaT-binding aan LUZ24 DNA door LUZ24 gp4. Daardoor werd dit faageiwit hernoemd tot Mip, het MvaT-inhiberende proteïne. Dit eiwit zorgt er dus vermoedelijk voor dat hetfaag-DNA direct na injectie in de gastheer vrij blijft van MvaT-polymeren, zodat transcriptie van het DNA mogelijk blijft en zodat de infectiecyclus kan voltooid worden, hetgeen de faag een duidelijk voordeel geeft.
Hoewel microbiële resistentie een onvermijdelijk gevolg is van antibioticumgebruik, heeft een
faag-gebaseerd platform een groot potentieel om nieuwe mechanismen en doelwitten te vinden om bacteriële infecties te behandelen. Reeds beschreven faag-gastheerinteracties illustrerendat ze zwakke punten in de gastheer kunnen blootleggen. De meest effectieve en gevoelige doelwitten werden als het ware reeds door de evolutie geselecteerd door de natuurlijke vijanden van de
bacteriën. Gezien denatuur een onuitputtelijke bron is van nieuwe fagen, zou de zoektocht naar lethale faageiwitten en hun bacteriële doelwitten in de toekomst verder gezet moeten worden in het onderzoek naar nieuwe antimicrobiële therapieën.
reactiewegen aanpakken.
Lytische (bacterio)fagen, de natuurlijke vijand van bacteriën, zijn volledig afhankelijk vanhet bacteriële metabolisme van hun gastheer voor hun vermenigvuldiging.Gedurende miljoenen jaren coëvolutie hebben fagen een grote diversiteitaan eiwitten ontwikkeld die specifieke bacteriële processen inhiberen of omvormen in hun eigen voordeel. Een heel aantal van dergelijke interacties leiden tot een tijdelijke groeistop of zelfs het afdoden van de gastheer. Gebaseerd op deze observatie zou het exploreren van alle beschikbare faaggenomen en de hierop gecodeerde eiwitten een nieuwe bron kunnen zijn van antibacteriële middelen.
In dit werk werd vertrokken vaneen selectie van 158 vroege faageiwitten van negen verschillende
bacteriofagen van P. aeruginosa</>. Vervolgens werd op zoek gegaan naar groei-inhibitorische faageiwitten, gezien deze de grootste kans hebben te interageren met essentiële doelwitten in hun gastheer. Door de eiwitten individueel tot expressie te brengen in P. aeruginosa</> PAO1 werden negentien verschillende onbekende faageiwitten met antibacteriële activiteit
geïdentificeerd.
Om hun werkingsmechanisme te bestuderen, werd voor elk van de antibacteriële faageiwitten een systematische yeast two-hybrid eiwit-eiwitinteractieanalyse uitgevoerdtegen een willekeurige genomische fragmentenbank van P. aeruginosa</> PAO1. Hieruit bleek dat fagen het gastheermetabolisme op zeer veel verschillende manieren beïnvloeden.
Een mooi voorbeeld is LUZ24gp4. Voor dit faageiwit werd als potentiële interactiepartner in P. aeruginosa</> transcriptiefactor MvaT geïdentificeerd, wat ook bevestigd werd in vitro door coprecipitatie. MvaT is een histon-achtig eiwit, dat door de vorming van oligomeren een cruciale rol heeft in het compact houden van het bacteriële chromosoom. Bovendien laat polymerisatie van het eiwit en binding aan AT-rijk DNA het stilleggen van de expressie van bepaalde genen, gelegen op het AT-rijke DNA, toe. Hierdoor worden mogelijke negatieve effecten van niet-eigen DNA, dat meestal AT-rijk is, tot een minimum herleid. Gel shift experimenten met recombinant aangemaaktMvaT en LUZ24 gp4 bevestigden de inhibitie van MvaT-binding aan LUZ24 DNA door LUZ24 gp4. Daardoor werd dit faageiwit hernoemd tot Mip, het MvaT-inhiberende proteïne. Dit eiwit zorgt er dus vermoedelijk voor dat hetfaag-DNA direct na injectie in de gastheer vrij blijft van MvaT-polymeren, zodat transcriptie van het DNA mogelijk blijft en zodat de infectiecyclus kan voltooid worden, hetgeen de faag een duidelijk voordeel geeft.
Hoewel microbiële resistentie een onvermijdelijk gevolg is van antibioticumgebruik, heeft een
faag-gebaseerd platform een groot potentieel om nieuwe mechanismen en doelwitten te vinden om bacteriële infecties te behandelen. Reeds beschreven faag-gastheerinteracties illustrerendat ze zwakke punten in de gastheer kunnen blootleggen. De meest effectieve en gevoelige doelwitten werden als het ware reeds door de evolutie geselecteerd door de natuurlijke vijanden van de
bacteriën. Gezien denatuur een onuitputtelijke bron is van nieuwe fagen, zou de zoektocht naar lethale faageiwitten en hun bacteriële doelwitten in de toekomst verder gezet moeten worden in het onderzoek naar nieuwe antimicrobiële therapieën.
Datum:1 okt 2009 → 23 jun 2014
Trefwoorden:Pseudomonas aeruginosa, Antibiotic resistance, Bacteriophages, Bacteriophage-host interactions, Interactomics, Yeast two-hybrid, Antimicrobial targets, (co)crystallography
Disciplines:Engineering van biomaterialen, Biologische systeemtechnologie, Biomateriaal engineering, Biomechanische ingenieurswetenschappen, Andere (bio)medische ingenieurswetenschappen, Milieu ingenieurswetenschappen en biotechnologie, Industriële biotechnologie, Andere biotechnologie, bio-en biosysteem ingenieurswetenschappen
Project type:PhD project