De ontrafeling van het verborgen potentieel van twee 'ORFans' van Pseudomonas virus LUZ7

De gramnegatieve bacterie Pseudomonas aeruginosa is een veelzijdige bacterie die in staat is te gedijen in sterk variërende omgevingen. Door de selectiedruk die het veelvuldig antibioticagebruik veroorzaakt, is deze pathogene bacterie resistent geworden tegen veel van de antibiotica die tegenwoordig gebruikt worden. Het voorkomen van multidrugresistente en panresistente stammen van deze, voor de mens opportunistische, pathogeen maakt het op de dag van vandaag een van de meest gevaarlijke bacteriële ziekteverwekkers. Er is dan ook een dringende nood aan nieuwe antibacteriële behandelingen. Virussen van bacteriën (bacteriofagen) kunnen hier een grote bijdrage toe leveren. Enerzijds kunnen zij in hun geheel gebruikt worden als zelf-replicerend antibacterieel middel. Anderzijds coderen zij verschillende eiwitten die gebruikt kunnen worden om infecties te bestrijden. Bovendien zijn fagen evolutionair aangepast om cruciale gastheerprocessen te inhiberen, activeren en moduleren. Dit doen ze vooral via eiwitten die vroeg tijdens de infectie tot expressie gebracht worden. Het bestuderen van deze eiwitten kan aldus belangrijke doelwitten voor het ontwikkelen van antimicrobiële stoffen aanwijzen en inzichten geven in hoe deze gemaakt kunnen worden. Bijkomend kan het beïnvloeden van deze belangrijke processen interessante toepassingen hebben voor de synthetische biologie.

In bacteriofaaggenomen is er is een grote verscheidenheid aan eiwitten gecodeerd die op hun beurt kunnen leiden tot een grote hoeveelheid aan potentieel interessante antibacteriële toepassingen en biotechnologische middelen kunnen leiden. Het overgrote deel aan vroege genen zijn echter ‘ORFans’. Genen die geen enkele gelijkenis vertonen met gekende genen. Dit maakt het moeilijk om hun functie te achterhalen en vereist een op maat gemaakte aanpak voor elke ORFan. Het doel van deze thesis is om twee ORFans van Pseudomonas virus LUZ7, die toxisch zijn voor de cel te karakteriseren. Het bestuderen van deze ORFans zal ons toelaten om de biologie van de faag beter te begrijpen en toelaten om hun potentieel voor verschillende faagafgeleide toepassingen in te schatten.

De eerste ORFan die hier bestudeerd wordt is gp8 van faag LUZ7. Dit eiwit is zeer toxisch wanneer het tot expressie gebracht wordt in P. aeruginosa. Dit eiwit veroorzaakt een volledige groeistop en lysis van de cel. Het eiwit werd in het verleden reeds bestudeerd met eiwit-eiwitinteractiescreens en functionele testen. Desondanks zijn de eigenlijke functie en het doelwit in de gastheer nog niet ontrafeld. Deze thesis bouwt verder op dit initiële werk. Om te beginnen werd de interactie met de voorgestelde interactiepartners, DnaB en RibB (gebaseerd op yeast two-hybrid) alsook de interactie met de twee toxiciteitscomplementerende eiwitten PA0842 en PA3778, nagegaan. Het was echter niet mogelijk om interactie tussen gp8 en een van deze eiwitten te bevestigen. Interessant genoeg is er wel een interactie gevonden met het histidinesynthese-enzyme HisC1. Dit was een hit uit de vroegere yeast two-hybrid screen maar werd initieel niet bevestigd als een echte interactiepartner. Hoewel deze interactie hier wel bevestigd kon worden in verschillende onafhankelijke testen, kan de interactie tussen gp8 en HisC1 niet gelinkt worden aan de toxiciteit van gp8. Inderdaad, noch overexpressie van HisC1, noch knock-out van het HisC1-coderende gen, kon deze toxiciteit ongedaan maken. Bovendien lijkt in preliminaire testen de enzymatische activiteit van HisC1 niet beïnvloed te worden door gp8. Hierdoor is het vooralsnog onduidelijk wat de echte biologische functie van gp8 is en welke invloed het op het histidine metabolisme heeft. Om de effecten van gp8 beter te begrijpen, werd het ook meer structureel gekarakteriseerd. Hierbij werden vijf aminozuren gevonden die belangrijk zijn voor toxiciteit van gp8. De eiwitstructuur zelf werd nog niet ontrafeld omdat de instabiliteit van gp8 de NMR metingen over langere periodes verhinderde. Deze instabiliteit is waarschijnlijk veroorzaakt door de vorming van disulfidebruggen. Het toevoegen van een reducerend agens aan de eiwitbuffer zou dus toekomstige structuurstudies moeten toelaten. Gebaseerd op onze resultaten, suggereren we dat gp8 waarschijnlijk andere processen dan het histidine metabolisme beïnvloedt of dat het HisC1 op een meer subtiele wijze beïnvloedt. Mogelijks is het een schakelaar die het gebruik van energie ofwel richting de histidinebiosyntheseweg of de hieraan gelinkte purinebiosyntheseweg stuurt. Verder onderzoek is echter nodig om deze hypothese na te gaan.

De tweede ORFan die hier bestudeerd wordt is LUZ7 gp14. Dit eiwit is ook toxisch voor P. aeruginosa en veroorzaakt een filamenteuze groei van de bacterie. Eerder werd gevonden dat dit eiwit negatieve effecten heeft op de transcriptie door de gastheer. Er werden echter geen interacties met gastheereiwitten, inclusief het RNA-polymerase waargenomen. Dit leidde tot de hypothese dat gp14 met nucleïnezuren interageert. In dit onderzoek konden we vaststellen dat het eiwit verscheidene nucleïnezuren kan binden met een voorkeur voor ssDNA. De ontrafeling van de kristalstructuur aan 2.20 Å toont dat het DNA kan binden als dimeer en dat het een vouwing heeft die nieuw is voor enkelstreng DNA bindende eiwitten (SSBs). Met aminozuursubstitutie- en truncatiemutanten konden de eerste inzichten in het DNA bindingsmechanisme verkregen worden. Het mechanisme is gelijkaardig aan andere SSB eiwitten, waarbij aromatische residuen stapelinteracties aangaan met de DNA-basen en positief geladen residuen interageren met de DNA-ruggengraat. Om de biologische rol van het SSB in de cel te begrijpen, werd de aanwezigheid van SSB eiwitten in de gerelateerde faag N4 vergeleken met die van LUZ7. Interessant was dat een homoloog van het SSB dat nodig is om de overgang te maken van transcriptie van vroege genen naar middelgenen (N4 gp2), niet geïdentificeerd werd in LUZ7. In N4 bindt gp2 de enkelstrengige regio van gesmolten promoter-DNA en recruteert het het faag-gecodeerde RNA-polymerase (RNAPII) naar de promoters om hun transcriptie te activeren. Er werd gevonden dat gp14 (Drc genoemd; ssDNA-binding RNA Polymerase Cofactor) ook interageert met RNAPII. Dit wijst erop dat het mogelijks functioneel equivalent is aan gp2, ondanks dat ze onderling geen sequentiehomologie vertonen. Het lijkt er wel op dat Drc zijn functie op een andere manier vervult dan gp2. Gp2 heeft namelijk een cofactor nodig om het promoter DNA te smelten, terwijl Drc hier geen nood aan heeft. Initiële experimenten wijzen er bovendien op dat ook de promoters zelf verschillend zijn. Een gedetailleerde analyse van de aanwezigheid van Drc en gp2 homologen binnen de verschillende N4-gerelateerde genera toont dat er een duidelijk onderscheid is tussen groepen die het ene of het andere SSB gebruiken. Sommige groepen lijken zelfs geen van beide eiwitten te coderen, wat erop wijst dat bijkomende SSBs kunnen bestaan. Dus, hoewel het transcriptieschema van N4 over het algemeen geconserveerd is bij N4-gerelateerde genera, wijst dit onderzoek op belangrijke verschillen in regulatie van middel-gentranscriptie binnen de groep van N4-achtige fagen.

De eiwitten die hier bestudeerd werden, tonen mooi het verborgen potentieel in ORFan eiwitten. De studie van deze twee eiwitten heeft nieuwe eiwitfuncties, een nieuwe vouwing en zelfs inzichten in biologische basisprocessen zoals transcriptieprogressie tijdens faaginfectie blootgelegd. Vermits deze twee eiwitten slechts een heel klein stukje zijn van de enorme hoeveelheid ORFans die er zijn, is het duidelijk dat ORFans een schat aan nog te ontdekken functies en tools bevatten. De studie toont echter ook aan dat elke ORFan een op maat gemaakte aanpak vereist om ze te bestuderen. Dit maakt dat het toewijzen van een functie aan ORFans een van de belangrijkste drempels om te overkomen voor de moleculair bioloog. Mogelijks kan een systematische structuurbepaling in combinatie met de screening-gebaseerde technieken, die gebruikt worden om initiële inzichten te verkrijgen, ervoor zorgen dat de eiwitfunctie sneller bepaald kan worden. Bovendien zal een toename in hoeveelheid gekende structuren ervoor zorgen dat voorspellingen van functie verbeteren. Zo kan het grote verschil tussen hoeveelheid nieuw ontdekte ORFan-sequenties en hun functionele toewijzing misschien iets kleiner gemaakt worden.

De twee eiwitten die in deze dissertatie gekarakteriseerd werden, kunnen mogelijks gebruikt worden in een waaier aan toepassingen. Enerzijds kan gp8 een interessant voorbeeld zijn voor de ontwikkeling van antibacteriële middelen. De histidinebiosyntheseweg, waarmee gp8 interageert, werd in het verleden reeds gesuggereerd als potentieel doelwit voor antibiotica. Echter is het toxiciteitsmechanisme van gp8 nog niet volledig begrepen en mogelijks wordt het veroorzaakt door een interactie met een ander proces in de cel. Vermits gp8 zo toxisch is met groeistop en lysis van de cel tot gevolg zou het de moeite lonen om dit mechanisme verder te onderzoeken. Voor synthetische biologie kan gp8 interessant zijn voor het aanpassen van de histidine reactieweg om productie van aminozuren te verbeteren. Ook voor deze toepassing zijn extra inzichten in de exacte effecten van gp8 op de metabolische reactieweg noodzakelijk. Anderzijds zal Drc weinig toepasselijk zijn voor antibioticaontwikkeling vermits het interageert met nucleïnezuren. In combinatie met zijn RNA-polymerase (RNAPII), kan het echter heel bruikbaar zijn voor het ontwerpen van circuits in de synthetische biologie. Door zijn vermogen om promoter-bevattend DNA te binden wanneer dit onder torsiestress staat, kan het dienen als een sensor voor processen die deze torsie beïnvloeden. Bovendien kan het, doordat het gebruikt maakt van twee RNA-polymerase-subunits en een SSB, gebruikt worden voor de bouw van (bio)logische EN-poorten die afhankelijk zijn van bijkomende inputs.

Deze studie legt een klein stukje faagvernuft bloot dat gecodeerd wordt door ORFans en waarvan nog veel meer te ontdekken valt. Het is nu aan het vernuft van de mens om deze ORFans, die oorspronkelijk gebruikt werden ten goede van de faag, om te bouwen tot iets dat ten goede komt van ons allemaal.