Identificatie van de transcriptiefactoren en (epi)genetische elementen die het vitamine C gehalte in appelvruchten controleren.

‘An apple a day keeps the doctor away’: dit spreekwoord vat goed samen dat appels vol gezonde bestanddelen zitten. Vitamine C (ascorbinezuur, Asc) is een van die bestanddelen en is met name interessant omdat het zowel een vitamine als een antioxidant is. Aangezien vitamine C niet alleen cruciaal is voor de menselijke voeding, maar ook de bewaarbaarheid van appels en hun resistentie tegen (a)biotische stress kan verhogen, is het vitamine C-gehalte een interessante eigenschap om te verbeteren in appelgewassen. Om appelcultivars met een hoog vitamine C‑gehalte te kunnen kweken is het belangrijk om inzicht te krijgen in de natuurlijke biodiversiteit van het vitamine C-gehalte in appelvruchten. Daarom werden in dit doctoraat de concentraties ascorbinezuur (Asc), dehydroascorbinezuur (DHA), en total Asc (Asc + DHA) in het vruchtvlees van 79 oude en recente appelcultivars bij de oogst geanalyseerd. Er was sprake van significante variatie in het Asc- (21-voudig), DHA- (149-voudig) en total Asc-gehalte (11-voudig) van het vruchtvlees, wat wijst op een grote onderliggende genetische biodiversiteit. Bij een analyse van de populatiestructuur op basis van 8K SNP high density genotyping kwamen er twee groepen naar voren in dit germplasma: één groep met 21 elitevariëteiten en een tweede groep met 58 lokale/niet-commerciële variëteiten. Het gemiddelde (total) Asc-gehalte in het vruchtvlees van lokale en elitevariëteiten was vergelijkbaar, waarschijnlijk doordat er nooit gericht geselecteerd werd voor dit voedingsaspect van appel. Van de 79 gescreende appelcultivars werden de tien genotypes met de hoogste of de laagste concentratie aan total Asc in het vruchtvlees bij de oogst gebruikt om de vitamine C-dynamiek te monitoren tijdens de vruchtontwikkeling en de daaropvolgende koude bewaring en bewaring bij kamertemperatuur. Wat de Asc/DHA-ratio betreft, helde de balans tijdens de vruchtontwikkeling in het algemeen over naar de gereduceerde vorm (Asc), terwijl er tijdens de bewaring een evolutie merkbaar was naar een meer geoxideerde (DHA) toestand. Voor elk van de tien geanalyseerde cultivars had de appelschil een hoger vitamine C-gehalte dan het vruchtvlees op eender welk moment tijdens de vruchtontwikkeling en de bewaring, wellicht door de fotosynthetische activiteit en de directere blootstelling aan abiotische en biotische stress (irradiatie, ozon, pathogenen...), fenomenen die veel reactieve zuurstofcomponenten produceren, die door antioxidanten, zoals vitamine C, onschadelijk gemaakt moeten worden. Uit een correlatieanalyse bleek dat de hoeveelheid total Asc in het vruchtvlees positief correleerde met die in de schil tijdens de vruchtontwikkeling en bewaring van de tien geselecteerde cultivars.

Van de tien genotypes waarvan de vitamine C-dynamiek geanalyseerd werd, vertoonden Gloster, Nicogreen en Marie Joseph d'Othée (MJD) het meest differentiële verloop van het Asc-gehalte in het vruchtvlees tijdens de vruchtontwikkeling en de daaropvolgende koude bewaring. Bovendien vertoonden de drie cultivars vanaf het midden van de zomer systematisch verschillende Asc-gehaltes, waarbij MJD het hoogste gehalte had, gevolgd door Nicogreen, op zijn beurt gevolgd door Gloster. Daarom werden Gloster, Nicogreen en MJD geselecteerd om een RNA-sequentieanalyse op vruchtvleesstalen uit te voeren op vier tijdstippen tijdens de vruchtontwikkeling, d.w.z. na de junirui, in het midden van de zomer, aan het begin van de herfst en bij de oogst, en na de daaropvolgende koude bewaring. Aan de hand van deze experimentele opzet kon de transcriptionele regulatie van het Asc-metabolisme in verschillende cultivars tijdens de volledige levenscyclus van de appels onderzocht worden. De combinatie van vier verschillende biosynthesepathways en de wisselwerking tussen biosynthese-, recycling- en oxidatiepathways maakt de homeostase van Asc bijzonder complex. In de literatuur is er geen eensgezindheid over de mate waarin de transcriptionele regulatie van die verschillende pathways bijdraagt tot de Asc-concentratie in appelvruchtvlees, en of dat afhankelijk is van de tijd en/of van het genotype. Daarom richtte deze doctoraatsthesis zich in de eerste plaats op de expressie van de gekende Asc-metabolische genen om de dynamiek en de relevantie van de verschillende Asc-pathways in appelvruchtvlees bloot te leggen. Uit de resultaten bleek dat de D-mannose/L-galactose- en D-glucuronaat-biosynthese-pathway samen met de Asc-recyclage- en Asc-oxidatiepathway transcriptioneel geactiveerd werden tijdens de vruchtontwikkeling en koude bewaring en dus wellicht betrokken zijn bij de Asc-homeostase in het appelvruchtvlees. Geen van de betrokken Asc-metabolische genfamilies kwamen verschillend tot expressie tussen Gloster, Nicogreen en MJD tijdens de vruchtontwikkeling, wat wijst op een geconserveerde transcriptionele regulatie van de verschillende Asc-metabolische enzymen. De correlatie tussen de Asc-dynamiek en de expressie van Asc-metabolische genfamilies was daarentegen zeer cultivar- en tijdspecifiek. In tegenstelling tot de Asc-concentraties leek het DHA-gehalte wel bepaald te worden door de transcriptionele hoeveelheden van Asc-metabolische genen in alle drie de cultivars. Interessant is dat de expressie van AO15.1, dat codeert voor een Asc-oxidatie-enzym, positief correleerde met de DHA-concentratie in alle drie de cultivars en daarom het enige gemeenschappelijke Asc-metabolische gen was waarvan het expressieniveau een invloed leek te hebben op het Asc-metabolisme.

Daarnaast werden de RNA-seq-gegevens gebruikt om mogelijke upstreamregulatoren van het Asc-metabolisme in appelvruchtvlees op te sporen. Er werden negen mogelijke appeltranscriptiefactoren ontdekt die de transcriptiehoeveelheid van specifieke Asc-metabolische genen in Gloster, Nicogreen en MJD lijken te bepalen tijdens de vruchtontwikkeling en de daaropvolgende bewaring. MYB5.11b, vier Dof22-isozymen en HSF24 zijn mogelijk positieve transcriptionele regulatoren van Asc-metabolische genen in appel, aangezien de expressiedynamiek van hun genen sterk positief gecorreleerd was met de expressieprofielen van genen die coderen voor de Asc-biosynthese-enzymen GGP, GPP, GDH en/of het Asc-recyclingenzym GR. Daarentegen hebben de veronderstelde regulatoren nsLTP1.11, AS1 en MYC2 waarschijnlijk een negatief effect op de grootte van de gereduceerde Asc-pool, aangezien de expressie van de corresponderende genen sterk positief correleerde met de expressie van genen uit de Asc-oxidatie-genfamilies, AO en APX. De expressie van AS1 correleerde positief met de expressie van AO15.1 in alle cultivars, wat aangeeft dat niet alleen de invloed van de transcriptiehoeveelheid van AO15.1 op het Asc-metabolisme geconserveerd is in het vruchtvlees van rijpende en koud bewaarde appels, maar ook de upstream transcriptionele regulatie van AO15.1 zelf. De Myb5-, Dof22- en nsLTP1-genen zijn orthologen van genen die coderen voor transcriptiefactoren waarvan bekend is dat ze het Asc-gehalte in andere (model)gewassen beïnvloeden, wat de hypothese versterkt dat hun genproducten ook in appel een invloed hebben op het Asc-metabolisme.

Tot slot werd er een differentiële genexpressie-analyse uitgevoerd om genen in het vruchtvlees van appels te vinden die differentieel tot expressie komen in de tijd en tussen cultivars en daarom transcriptioneel gereguleerd zouden kunnen worden door de (total) Asc-concentratie. Er waren geen differentieel tot expressie gekomen genen waarvan de expressie op dezelfde manier correleerde met de (total) Asc-concentratie in alle drie de onderzochte cultivars, wat suggereert dat de invloed van vitamine C op gentranscriptie niet geconserveerd is in appelvruchtvlees.

Samen met toekomstige studies over de proteïnehoeveelheden en de enzymefficiëntie van de Asc-metabolische genproducten zou dit transcriptionele onderzoek de complexe regulatie van het Asc-metabolisme in appelvruchtvlees kunnen blootleggen. Doordat in dit onderzoek verschillende Asc-metabolische kandidaat-genen en kandidaat-transcriptiefactoren naar voren geschoven worden, wordt het pad geëffend voor de verdere validatie van het belang van deze kandidaten en uiteindelijk voor de veredeling van commerciële appelcultivars met een verhoogd Asc-gehalte in het vruchtvlees.