Vitamine D analogen in combinatie met palbociclib als behandeling voor triple-negatieve borstkanker – preklinische evaluatie en signaaltransductie

1,25(OH)2D3, de bioactieve vorm van vitamine D3, is een belangrijke factor die de calcium en fosfaat balans in het lichaam reguleert. Na het binden van 1,25(OH)2D3 aan de vitamine D receptor (VDR) en het initiëren van een dimeer met de retinoïde X receptor (RXR), migreert dit complex naar de celkern om vervolgens te binden aan de vitamine D responsieve elementen (VDREs), gelegen in de promoter regio van doelwitgenen. Dit initieert de transcriptie van genen belangrijk in verschillende biologische processen zoals celproliferatie, differentiatie, immuunmodulatie, apoptose en celmetabolisme. Deze effecten worden geïnduceerd in zowel gezonde als kwaadaardige cellen zoals borstkankercellen. Echter om deze effecten te verkrijgen zijn hoge dosissen van 1,25(OH)2D3 noodzakelijk, waardoor calcemische bijwerkingen kunnen ontstaan. Om dit probleem op te lossen werden vitamine D3 analogen ontwikkeld. Deze moleculen hebben een afwijkende chemische structuur waardoor ze sterkere anti-kankereffecten en een verminderde calcemische werking hebben. Een analoog dat heel sterke antiproliferatieve effecten heeft en verminderde calcemische neveneffecten in vergelijking met 1,25(OH)2D3 is inecalcitol. Deze analoog werd ontwikkeld in samenwerking met het Departement Organische Chemie aan de Universiteit van Gent en heeft de capaciteit om celproliferatie te verminderen door de G1-S-overgang van de celcyclus te blokkeren. Behandeling met inecalcitol leidt ook tot een verminderde tumorgroei in een muismodel afgeleid van oestrogeen receptor-positieve borstkankercellen.

Borstkanker is een veel voorkomende aandoening met 2,3 miljoen diagnoses elk jaar wereldwijd. Door de hoge prevalentie van deze ziekte blijft het dan ook noodzakelijk om nieuwe therapieën te ontwikkelen. Celcyclus genen zijn vaak fout gereguleerd in borstkankercellen wat heeft geleid tot de ontwikkeling van verschillende selectieve celcyclus inhibitoren zoals palbociclib. Ondertussen wordt deze CDK4/6 inhibitor gebruikt ter behandeling van hormoonreceptor-positieve, HER2 receptor-negatieve gemetastaseerde borstkanker in combinatie met hormoontherapie. Tot nu toe wordt palbociclib niet gebruikt voor de behandeling van triple-negatieve borstkanker.

Omdat in ongeveer 60 % van de invasieve borsttumoren de VDR tot expressie komt, onderzochten we of de vitamine D signaalcascade een mogelijk doelwit kon zijn om de groei van borstkankercellen te remmen. Daarom wilden we nagaan of het combineren van inecalcitol met de CDK4/6 inhibitor palbociclib een mogelijk sterker anti-kankereffect kon induceren dan beide therapieën afzonderlijk. Daarenboven wilden we onderzoeken of het toevoegen van inecalcitol, de gevoeligheid voor palbociclib behandeling verhoogt in triple-negatieve borsttumoren. Verder hebben we deze combinatietherapie niet alleen op cellen maar ook in een muismodel onderzocht zodat we ook de in vivo effecten beter konden bestuderen. Als laatste hebben we het effect van de combinatietherapie op celmetabolisme onderzocht door gerichte tracer metabolomics uit te voeren.

In een eerste doelstelling binnen deze studie onderzochten we het effect van de inecalcitol en palbociclib behandeling, alleen of in combinatie, op verschillende borstkankersubtypes: hormoongevoelige (T47D-MCF7) en triple-negatieve (BT20, HCC1143 en Hs578T). Door gebruik te maken van verschillende technieken, detecteerden we dat het combineren van inecalcitol met palbociclib vooral effectief was in het inhiberen van celgroei en -proliferatie binnen de hormoongevoelige borstkankercellijnen (T47D-MCF7), terwijl het effect minder uitgesproken was in de triple-negatieve subgroep. Behandeling met inecalcitol alleen of in combinatie verhoogde ook het aantal apoptotische cellen binnen de hormoongevoelige MCF7 cellijn, terwijl we geen effect op apoptose konden observeren binnen de triple-negatieve cellijn. Dit versterkte antiproliferatieve effect binnen de hormoongevoelige cellijnen werd bevestigd na analyse van de celcyclus door middel van PI FACS kleuring alsook door western blot analyse waar we konden aantonen dat de celcyclus regulatoren (p)-Rb en (p)-CDK2 sterk verminderd tot expressie kwamen na combinatiebehandeling. Verder beïnvloedde de combinatietherapie ook de Akt/PI3K/mTOR signalering, belangrijk bij celgroei. In MCF7 cellen werd deze signaalcascade geactiveerd door de combinatietherapie terwijl in triple-negatieve cellen deze signaalcascade werd geïnhibeerd. Daarnaast observeerden we ook veranderingen binnen de mitochondriale homeostase. De inecalcitol en palbociclib combinatietherapie induceerde een stijging in mitochondriale ROS productie en het aantal mitochondriën in beide cellijnen.

In een tweede doelstelling bestudeerden we het effect van de combinatietherapie op tumorgroei door gebruik te maken van een borstkanker muismodel afgeleid van een hormoongevoelige (MCF7) en triple-negatieve (BT20) cellijn. Na een dosistitratie studie hebben we de optimale combinatiedosis bepaald zonder het veroorzaken van calcemische nevenwerkingen. In lijn met de resultaten van de in vitro studie, zagen we ook in ons muismodel enkel een effect op tumorgroei en -gewicht in het hormoongevoelige model na behandeling met de combinatietherapie. Ook hier werden de celcyclus gereguleerde proteïnen p-Rb en p-CDK2 geblokkeerd door de combinatie behandeling wat een vermindering in celproliferatie binnen de tumoren induceerde. Ondanks dat we geen calcemische nevenwerkingen observeerden tijdens de dosistitratie studie, verhoogde de behandeling met inecalcitol en de combinatietherapie de calcium concentraties in serum en urine in beide muismodellen. Desondanks waren het botvolume en de hoeveelheid calcium in de femur niet veranderd na behandeling, was suggereert dat calcium niet uit het bot werd vrijgesteld.

In het laatste onderdeel van dit project, onderzochten we het effect van de behandeling op het glutamine metabolisme binnen de hormoongevoelige (MCF7) en triple-negatieve (BT20) borstkankercellijnen. Door de cellen te labelen met [U-13C]-glutamine, konden we nagaan welke signaalcascades veranderd werden door de behandeling en door verschillende tijdspunten te analyseren, namelijk 24 en 72 uur, kregen we ook een duidelijk zicht op primair en secundair geïnduceerde effecten. De combinatietherapie reguleerde vooral de citroenzuurcyclus, aminozuren en nucleotiden na 72 uur behandeling, wat suggereert dat secundaire effecten geïnduceerd werden na celcyclus inhibitie door beide producten. We zagen verschillende effecten van de inecalcitol mono- en combinatietherapie op de regulatie van deze signaalcascades, waarbij vooral in MCF7 cellen de combinatiebehandeling een verminderde glutamine incorporatie induceerde in de citroenzuurcyclus en pyrimidine nucleotiden UTP en CTP. Alsook induceerde de combinatietherapie de daling van het aminozuur aspartaat terwijl dit opgereguleerd werd in de triple-negatieve borstkankercellen. De verschillende regulatie van glutamine metabolisme binnen deze cellijnen wijzen opnieuw op het verschil in gevoeligheid voor de combinatietherapie.

We kunnen dus besluiten dat het combineren van een vitamine D3 analoog met een CDK4/6 inhibitor anti-kankereffecten vertoonde in hormoongevoelige borstkankercellen. Bovendien verschaften we nieuwe inzichten in de onderliggende signaalcascades geïnduceerd door deze behandeling in verschillende borstkankersubtypes.