< Terug naar vorige pagina

Project

Photochromische biosensoren en beeldvorming voor interactiesensing bij lage expressieniveaus

De complexe processen die zich voordoen in de biologische cel bestaan vaak uit interacties tussen meerdere moleculen, die plaatsvinden in een spatiotemporele context. Fluorescentiemicroscopie is een gevestigde techniek die het mogelijk maakt om zulke processen te bestuderen in de ongerepte cel. Door het gebruik van fluorescente merkers wordt de verdeling en activiteit van biomoleculen gekoppeld aan een microscopisch waarneembaar fluorescent signaal. Voor celbiologen genieten fluorescente proteïnen (FPs) hier de voorkeur als merkers aangezien ze genetisch geëncodeerd en daarom minimaal invasief zijn voor de levende cel. 

Sommige van deze FPs kunnen dynamisch gemoduleerd worden vanwege hun interacties met licht, het binden aan andere moleculen, of vanwege veranderingen in hun biochemische omgeving. Dit is waardevol voor toepassingen met biosensoren, waar deze ‘slimme’ kenmerken omgezet kunnen worden naar een maat voor cellulaire activiteit. Bovendien zijn deze ‘slimme’ eigenschapen geschikt voor microscopie doeleinden die de spatiele resolutie, het contrast en de gevoeligheid verbeteren.

Vooruitgang in celbiologie zal mede afhangen van nieuwe FP technologieën en beeldvormingsmethoden, zodoende het complexe web van intracellulaire communicatienetwerken en zijn spatiotemporele organisatie te ontrafelen. Om tegemoet te komen aan deze uitdagingen is deze thesis er op gericht om, ten eerste, de eigenschappen van fluorescente proteïnen te begrijpen en manieren te vestigen om FPs te moduleren; ten tweede, deze benaderingen in te zetten als basis voor het ontwikkelen van nieuwe beeldvormingstechnieken; en tenslotte, nieuwe werkwijzen te bekomen voor biosensoren.

In deze thesis zullen deze doelen worden benaderd door het gebruik van drie verschillende mechanismen om fluorescente proteïnen te moduleren: het licht-geïnduceerde reversibele schakelgedrag van fluorescente proteïnen (RSFPs), de door binding-geïnduceerde modulatie van fluorescentie, en Förster resonance energy transfer. Na een introductie (Hoofdstuk 1) die deze principes behandelt en het onderzoeksdomein schetst, beschrijven de volgende hoofdstukken de resultaten die bekomen zijn door het implementeren en combineren van deze drie strategieën.

Eerst, in Hoofdstuk 2, beschrijf ik het gebruik van een antilichaam dat de fotoschakel eigenschappen moduleert van een reeks RSFPs, genaamd de rsGreens. Via een in vitro en in situ karakterisering tonen we aan dat de rsGreens bestaan uit twee onderling-converterende subtypes met verschillende fotoschakel kinetiek. Bovendien tonen we aan dat het binden van de nanobody zowel het spectroscopisch als fotoschakelgedrag van deze RSFPs verandert.

Vervolgens, in Hoofdstuk 3, implementeer ik het fotoschakelgedrag van RSFPs verder voor het simultaan meten van FRET-gebaseerde biosensoren. We tonen aan hoe het fotoschakelgedrag van een donor fluorofoor kan ingezet worden om twee spectraal overlappende FRET paren van elkaar te onderscheiden. Met een model dat het schakelgedrag beschrijft, valideren we onze nieuwe methode via numerieke simulaties. Ook tonen we haar toepasbaarheid aan voor metingen in levende cellen door gebruik te maken van een combinatie van nieuwe FRET-gebaseerde biosensoren.

Tot slot, Hoofdstuk 4 focust op het implementeren van een door binding-geïnduceerde modulatie van een reversibel merker systeem dat gebaseerd is op extrinsieke fluorescente proteïnen. In tegenstelling tot conventionele FPs heeft deze klasse van proteïnen fluorescente eigenschappen die afhangen van de (reversibele) binding van exogeen toegevoegde chromoforen. We beoordelen de toepasbaarheid van een fluorescente merker, splitFAST, en karakteriseren diens prestaties voor het visualiseren van cel receptor-activatie en daaruit voorkomende signalisatieprocessen.

Samengevat beschrijft dit proefschrift verscheidene mogelijkheden om fluorescente proteïnen in te zetten voor biosensor toepassingen. Via een synergistische aanpak tot het moduleren van FPs dragen onze resultaten bij aan de kennis over fluorescente proteïnen, met specifieke inzichten die betrekking hebben tot RSFPs. Dit vertaalt zich ook in nieuwe methoden, zoals we aantonen met onze ontmengingsstrategie, en effent de weg voor nieuwe klassen van biosensoren die het mogelijk maken om de complexiteit van levende systemen met fluorescentiemicroscopie te ontrafelen.

Datum:1 nov 2016 →  1 jul 2021
Trefwoorden:GPCR, Fluorescent Protein, Imaging
Disciplines:Biochemie en metabolisme, Medische biochemie en metabolisme, Systeembiologie
Project type:PhD project