< Terug naar vorige pagina

Project

Ontiwkkeling van gen- en farmacotherapie ter behandeling van zeldzame mutaties die een ernstige vrom van mucoviscidose veroorzaken

Mucoviscidose (cystische fibrose (CF), taaislijmziekte) is de meest voorkomende, levensbedreigende, autosomaal recessieve aandoening die wereldwijd meer dan 105.000 personen treft. De voornaamste oorzaak van morbiditeit en sterfte bij personen met CF is een progressieve longziekte, alhoewel CF vele organen aantast. CF-symptomen ontstaan door een verstoring van de ionen en water homeostase over het secretoire epitheel van deze organen. Dit wordt veroorzaakt door mutaties in het CFTR (CF transmembranair conductantie regulator) gen die resulteren in het verlies van functie van het CFTR chloride en bicarbonaat kanaal. Momenteel is er voor 401 CFTR mutaties reeds vastgesteld dat zij CF veroorzaken. Zij kunnen het proteïne op verschillende manieren beïnvloeden. Mutaties worden daarom onderverdeeld in verschillende klassen (Ia-Ib-II-III-IV-V-VI), waarbij er bij klasse Ia/b geen proteïne gevormd wordt, en bij klasse VI normaal werkende proteïnen worden gevormd die een verkorte levensduur hebben aan het plasmamembraan (PM). Veel mutaties hebben echter een combinatie van verschillende defecten, die allemaal aangepakt moeten worden om het fenotype te kunnen herstellen.

CFTR modulatoren zijn ontwikkeld om ofwel de vouwing en het transport van CFTR naar het PM te verbeteren (correctors) ofwel de kans dat het kanaal geopend is te verhogen (potentiators). Momenteel zijn er twee erg effectieve CFTR modulator therapieën op de markt: Kalydeco™ (potentiator monotherapie) en Trikafta™/ Kaftrio™ (drievoudige combinatie van correctors en potentiators). Met deze therapieën kan ongeveer 85% van de personen met CF behandeld worden. Echter, voor de overige 15% is er nog geen CFTR-afhankelijke therapie beschikbaar.

Tijdens dit doctoraat, focuste ik op missense mutaties die mogelijk gered konden worden door bestaande of nieuwe CFTR modulatoren of combinaties van CFTR modulatoren. Daarom startte ik met het karakteriseren van verschillende zeldzame CFTR mutaties (E60K, G85E, E92K, A455E, en N1303K) met een gekend proteïne verwerkingsdefect. Complementaire technieken werden gebruikt om de maturatie, lokalisatie en verplaatsing naar het PM als ook de functie van elk mutant proteïne na te gaan. Eveneens werd het effect van de corrector lumacaftor en de potentiator ivacaftor op deze processen geëvalueerd. Verschillende proteïne verwerkingsdefecten en functionele defecten werden geïdentificeerd voor de verschillende mutaties.  Alle mutaties, met uitzondering van G85E en N1303K, konden evenwel door de bestudeerde CFTR modulators worden gered. Er werd verder dan ook gefocust op G85E en N1303K, die werden bestudeerd in humane rectale organoïden waarin deze mutaties op minstens een allel aanwezig waren. De kwantificering van CFTR functie aan de hand van forskoline geïnduceerde zwelling in dit goed gekarakteriseerde primaire cel model heeft een goede correlatie met klinische eindpunten.

Eerst werd het effect van de nieuwe CFTR modulator elexacaftor, alleen of gecombineerd met andere types correctors en potentiators, bestudeerd. De functie van G85E werd efficiënt gered door enkel elexacaftor, maar nog beter door een combinatie met andere corrector types. Dit effect was vooral te danken aan het corrector mechanisme van elexacaftor. N1303K functie, aan de andere kant, werd slechts gedeeltelijk gered, en enkel wanneer zowel ivacaftor als elexacaftor werden toegevoegd. In dit geval werkte elexacaftor als een co-potentiator bovenop ivacaftor. De functie kon verhoogd worden door co-potentiator apigenine en/of corrector tezacaftor toe te voegen. Er werd dan een niveau van functie bereikt dat vergelijkbaar was met de functie van door lumacaftor/ivacaftor geredde F508del/F508del organoïden. Aangezien deze modulator combinatie is goedgekeurd voor personen homozygoot voor F508del, wordt aangenomen dat dit niveau van CFTR functie overeenkomt met klinische voordelen in personen met CF. Maar aangezien de redding van N1303K nog altijd slechts matig was, poogden wij om deze voor N1303K verder te verhogen. De hypothese was dat het verhogen van de hoeveelheid N1303K kanalen in het PM zou leiden tot een verhoging van de CFTR functie, aangezien er meer kanalen beschikbaar zouden zijn om gepotentieerd te worden. Bovendien kunnen de bestaande CFTR correctors, ontwikkeld voor F508del, N1303K PM expressie maar slechts ~1.6-voudig verhogen. In een kleine screen werd het effect van ~3000 moleculen op PM-expressie van N1303K geëvalueerd. Hieruit werd een molecule geïdentificeerd die de redding van de Trikafta™/Kaftrio™ combinatie tezacaftor/elexacaftor/ivacaftor kon verhogen. Het mechanisme van deze molecule wordt momenteel onderzocht.

In conclusie, bracht dit werk een strategie voort voor de evaluatie van zeldzame CFTR mutaties door deze te fenotyperen in complementaire cel modellen, zoals HEK293T cellen en primaire rectale organoïden van personen met CF, met het doel om bestaande CFTR modulator (combinaties) te identificeren die deze mutaties kunnen herstellen. Het stond daarnaast ook toe om te focussen op de N1303K mutatie, die nog onvoldoende hersteld werd met de bestaande CFTR modulator combinaties. Dit herstel kon vervolgens verbeterd worden door andere CFTR modulator combinaties te testen als ook door middel van een screen naar nieuwe CFTR modulatoren.

Datum:1 jan 2017 →  26 jan 2023
Trefwoorden:cystic fibrosis, mutations
Disciplines:Microbiologie, Systeembiologie, Laboratoriumgeneeskunde, Engineering van biomaterialen, Biologische systeemtechnologie, Biomateriaal engineering, Biomechanische ingenieurswetenschappen, Andere (bio)medische ingenieurswetenschappen, Milieu ingenieurswetenschappen en biotechnologie, Industriële biotechnologie, Andere biotechnologie, bio-en biosysteem ingenieurswetenschappen
Project type:PhD project