Het onderzoeken van axonale transport defecten in de ziekte van Charcot-Marie-Tooth type 1 en modificatie hiervan via selectieve inhibitie van histone deacetylase 6

De ziekte van Charcot-Marie-Tooth (CMT) is de meest voorkomende erfelijke neurologische aandoening van het perifere zenuwstelsel (PNS). Patiënten lijden aan licht tot ernstig spierverlies in de meest distale delen van hun lichaam in een 'stock-handschoen'-verdeling. Duplicaties in het gen dat codeert voor perifeer myeline-eiwit 22 (PMP22) veroorzaken de meest voorkomende vorm van CMT, CMT type 1A (CMT1A). PMP22 is een essentieel eiwit voor de initiatie en het onderhoud van Schwann-celmyelinisatie in het PNS. Myeline is een multilamellaire lipide-dichte structuur die Schwann-cellen produceren om snelle en efficiënte 'signalering' van PNS-sensorische en motorische axonen mogelijk te maken, zodat we sensorische informatie kunnen opnemen en kunnen reageren op onze omgeving. In CMT1A is bekend dat de duplicatie PMP22 lipidenmetabolismedefecten veroorzaakt die uiteindelijk CMT1A Schwann-cellen schaden in hun vermogen om PNS-axonen te myeliniseren, maar hoe PMP22-duplicaties dit veroorzaakten, is onbekend.

In het eerste deel van dit proefschrift hebben we onderzocht of het remmen van een bekende negatieve regulator van myelinisatie, histondeacetylaseremmer 3 (HDAC3), een waardevolle behandelstrategie was voor CMT1A met behulp van het C3 CMT1A muismodel. We hebben aangetoond dat vroege behandeling van CMT1A-muizen met de selectieve HDAC3-remmer (HDAC3i) de myelinisatie en myeline-ratio's verhoogde en de elektromyografie-opnames verbeterde. Een hoge dosis van de HDAC3i veroorzaakte echter een afname van de rotarod-prestaties en een afname van de algehele grijpkracht. Bovendien was de aanwezigheid van macrofagen in perifere zenuwen verhoogd in met HDAC3i behandelde CMT1A-muizen. We concluderen dat HDAC3 niet alleen een rol speelt bij het reguleren van myelinisatie, maar ook belangrijk is bij neuro-immuunmodulatie. Over het algemeen geven onze resultaten aan dat de juiste dosering van HDAC3-remmers van cruciaal belang is als ze worden vertaald naar een klinische setting voor demyeliniserende vormen van CMT of andere neurologische aandoeningen.

In het tweede deel van het proefschrift wilden we de moleculaire mechanismen onderzoeken die leiden tot een lipide metabool defect in CMT1A. Bulk RNA-sequencinggegevens van heupzenuwen van de C3- en de C22 CMT1A-muismodellen, die respectievelijk 5 en 8 kopieën van humaan PMP22 tot overexpressie brengen, toonden aan dat cholesterolmetabolisme de meest ontregelde route is tijdens hun ontwikkeling. Overexpressie van PMP22 had een dosisafhankelijk effect op de onderdrukking van het cholesterolmetabolisme. Lipidomische analyse van heupzenuwen van 5 weken oude C3-muizen onthulde ontregelde relatieve expressie van lipiden die de lipideopslag / druppelhomeostase, plasmamembraanidentiteit en zeer lange keten meervoudig onverzadigde vetzuren (VLC-PUFA's) reguleren. Om dit fenotype van het lipidemetabolisme in patiënt- en patiëntgecorrigeerde (isogene) afgeleide cellen te modelleren, hebben we een protocol voor geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) volgens Schwann-cellijn ontwikkeld. We differentieerden iPSC's naar Schwann-celprecursoren (iPSC-SCP's) en toonden via bulk-RNA-sequencing aan dat CMT1A-patiënt-afgeleide iPSC-SCP's een ontregelde expressie van plasmamembraan-geassocieerde genen hebben in vergelijking met hun isogene controle iPSC-SCP's. Lipidomische analyse van deze cellen onthulde op vergelijkbare wijze verandering in de relatieve expressie van lipiden die de identiteit van plasmamembraan, VLC-PUFA's en lipideopslag/druppelhomeostase reguleren. Met behulp van elektronenmicroscopie identificeerden we lipide-ophopingen in late endosoom-lysosomen in de CMT1A iPSC-SCP's. Bovendien benadrukte Di-4-ANEPPDHQ flowcytometrie-analyse dat verhoogde CMT1A iPSC-SCP-membranen meer ongeordend zijn in vergelijking met hun isogene iPSC-SCP. We hebben deze veranderingen verder onderzocht via confocale immunofluorescentiebeeldvorming met hoog gehalte om de cholesteroldistributie en de LD- en lysosoomdynamiek te analyseren. We ontdekten dat CMT1A iPSC-SCP's een verlaagd membraancholesterol hebben en, na oliezuurstimulatie, een grotere omvang en hoeveelheid LD's genereren. Dit LD/opslag-fenotype werd bevestigd met behulp van Western-blot-analyse die veranderingen liet zien in DGAT1, perilipin-2, seipin, LAMP1 en NPC1. Als proof-of-concept hebben we aangetoond dat behandeling met forskoline of progesteronantagonisten de tekorten in lipolyse/autofagie in CMT1A iPSC-SCP's kan moduleren en verbeteren. Bovendien laten we zien dat lipolyse / autofagie-modulatie in CMT1A iPSC-SCP's de homeostase van lipide-recycling verzwakt en het cholesterolgehalte van hun membranen herstelt.