< Terug naar vorige pagina

Project

Het Pizza proteïne als startpunt voor nano-buizen en helicale fibrillen

Hoewel proteïnen beschouwd worden als diverse en belangrijke bouwstenen in de natuur is het toch DNA dat het meest succesvolle is binnen de biochemie en - nanotechnologie. De voorkeur voor DNA komt voort uit het feit dat de interacties van DNA-basenparen beter begrepen worden dan de interacties van proteïnen wat het maken ervan vergemakkelijkt. Verder is de synthese van DNA ook goedkoper. Toch hebben proteïnebouwstenen de afgelopen jaren meer interesse verworven. Niet alleen door de verschillende structuren en functies die mogelijk zijn, maar ook doordat het verband tussen een proteïne en zijn sequentie, structuur en functie beter begrepen is. Verder speelde de snel groeiende rekenkracht een rol, alsook de toegankelijkheid ervan en de voorafgaande successen in het ontwerpen van proteïnen. Proteïnebouwstenen kunnen gebruikt worden voor diverse functies door verschillende eiwitdomeinen te combineren en vervolgens te functionaliseren. Proteïnebouwstenen kunnen zo gebruikt worden voor therapeutische doeleinden of als biomaterialen. Desalniettemin blijft het ontwerpen van proteïnen een uitdaging door de beperkte kennis over de stabiliteit en het vouwen, maar ook bij het ontwikkelen van proteïne complexen.

Wij focussen hier voornamelijk op de validatie van een eerder ontworpen proteïne, namelijk Pizza. Pizza is gebaseerd op een pseudosymmetrische β-propeller die volledig symmetrisch is gemaakt door het evolutieproces om te draaien. Later heeft men ook aangetoond dat Pizza gebruikt kan worden voor katalysereacties en dat Pizza proteïnen in staat zijn om metaalionen te coördineren. Wij focussen verder op Pizza om aan te tonen dat dit proteïne voldoende robuust is om te dienen als basis voor fusieproteïnen. Deze fusieproteïnen kunnen vervolgens gebruikt kunnen worden om tubulaire structuren te maken. Als laatste is er ook een achtvoud symmetrische β-propeller gemaakt en gevalideerd.

Het eerste hoofdstuk geeft een algemene inleiding over het ontwerpen van proteïnen. De eerste rationaal ontworpen proteïnen, zoals α-4 en Felix, worden kort vermeld. Verder wordt er een overzicht gegeven over de verschillende manieren waarop proteïnen ontworpen kunnen worden alsook het ontwerp van proteïnen met herhaalde structuren. Het laatste deel van dit hoofdstuk omvat een korte samenvatting waarbij gefocust wordt op de toepasbaarheid. Het tweede hoofdstuk omschrijft de specifieke doelen van dit onderzoek.

Het derde hoofdstuk is gebaseerd op een recent gepubliceerd artikel en gaat over het ontwerp van kleine moleculaire complexen. Deze complexen zijn ontworpen als fusieproteïnen van Pizza die, na assemblage, Pizza positioneren aan zowel de boven- als de onderkant. Al de ontworpen proteïnen werden vervolgens gevalideerd op basis van hun structuur, moleculair gewicht en oligomerisatie. Hoewel dit aantoont dat Pizza zodanig robuust is om te gebruiken als fusieproteïne werd het beste complex gebruikt om functionalisatie met behulp van een eGFP aan te tonen. Deze fusieproteïnen zouden verder gebruikt kunnen worden voor metaal geïnduceerde tubulaire structuren doordat Pizza aan beide kanten van het complex aanwezig is.

Het vierde hoofdstuk onderzoekt de mogelijkheid om tubulaire structuren te bekomen door de metaal coördinerende eigenschap van Pizza verder te onderzoeken. Een model werd ontworpen om de transitie van het cadmium nanokristal naar een cadmium nanoring te beschrijven. De specificiteit van Pizza werd verder onderzocht in aanwezigheid van verschillende metaalionen door middel van kristallografie. Door de aanwezigheid van aggregaten konden deze resultaten echter niet worden vastgesteld door andere technieken. Hoewel Pizza niet gebruikt kan worden voor metaal geïnduceerde tubulaire structuren benadrukt dit hoofdstuk het belang van een stabiele bouwsteen voor het coördineren van metaalionen.

Het vijfde hoofdstuk focust op het ontwerp en de validatie van een nieuw achtvoud symmetrische β-propeller, namelijk Bagel. Na het ontwerp van Bagel werd het proteïne tot expressie gebracht als meerdere proteïnen met twee tot negen β-platen met en zonder Velcro strap. Van elke proteïne werd vervolgens de thermische stabiliteit en oligomerisatie bepaald. Verder werd ook de metaalcoördinatie van Bagel geëvalueerd via zowel kristallografie als DLS metingen. Deze resultaten gaven aan dat Bagel er in slaagde om meerdere metaalionen te kunnen coördineren en telkens ook een dimeer vormde. Als laatste werd aangetoond dat Bagel voldoende robuust is om fusieproteïnen te ontwerpen. Hiervoor wered het beste resultaat van hoofdstuk drie gebruikt, maar ook werd een fusieproteïne op basis van Pizza en Bagel gemaakt. Preliminaire resultaten toonden aan dat de juiste oligomerisatie werd bekomen, wat zou kunnen leiden tot grotere moleculaire complexen of tubulaire structuren.

Het laatste hoofdstuk behandelt de algemene conclusie en toekomstperspectieven. De bijlagen bevatten extra informatie zoals de gebruikte sequenties, karakterisatie van proteïnen en een sectie over veiligheid, gezondheid en milieu.

Datum:1 sep 2016 →  1 feb 2021
Trefwoorden:helicale fibrillen, Pizza proteïne, nano-buizen
Disciplines:Biochemie en metabolisme, Medische biochemie en metabolisme, Systeembiologie
Project type:PhD project