< Terug naar vorige pagina

Project

Het rationeel ontwerpen van kleine molecuul modulators die de transcriptiefuntie van Salmonella typhimurium targetten, het PhoP beantwoordende regulator system

Pathogene bacteriën hebben tegen de meeste klinische antibiotica weerstand ontwikkeld. Besmettelijke ziektes, veroorzaakt door deze bacteriën, zijn een van de grootste uitdagingen voor de publieke gezondheid. Er is een dringende nood om nieuwe strategieën te ontwikkelen om deze besmettelijke ziekten te bestrijden. De traditionele antibiotica zijn ontwikkeld om de pathogenen af te doden of de groei te beletten. Er werd gesuggereerd dat verstoring van de virulentie factoren, zonder het afdoden of de groei te beletten, een veelbelovende strategie is om nieuwe antimicrobiële medicijnen te ontwikkelen die minder antibiotische weerstand veroorzaken. Het PhoP/PhoQ twee-componenten regulator systeem, betaat uit een histidine kinase PhoQ en een hiermee verbonden beantwoordende regulator, het PhoP. Deze laatste is de hoofd regulator van de kwaadaardigheidsfunctie van de pathogenen Salmonella enterica serovar Typhimurium en andere gram-negatieve bacteriën. Het PhoP proteïne is verantwoordelijk voor de regulatie van de expressie van meerdere genen betrokken in de kwaadaardigheid. Deze omvatten biofilm vorming, aanvoelen van voldoende aantallen, intracellulaire overleving en weerstand tegen antimicrobiële peptiden. Omwille hiervan is het moduleren van de transcriptie functie van het PhoP proteïne een attractief doel ter identificatie van nieuwe antimicrobiële stoffen.

Het hoofddoel van deze scriptie was het bestuderen of er tegen het PhoP proteïne een medicijn kan ontwikkeld worden, alsook kleine moleculen te identificeren die de transcriptiefunctie van het PhoP proteïne kunnen beïinvloeden. Computergestuurde medicijnontwikkeling hebben een belangrijke rol gespeeld in het beoordelen van: medicijn doel identificatie, hit identificatie, hit-to-lead selectie en lead optimalisatie. In deze scriptie werden berekeningsmethoden en biologische analyses geïntegreerd om het medicijnontwikkelingsproces te versnellen en te begrijpen. 
In het eerste deel van deze scriptie bestudeerden we of er een medicijn tegen het PhoP proteïne kan ontwikkeld worden alsook om de dynamica van het PhoP proteïne te begrijpen aan de hand van moleculaire dynamica simulaties. Omdat de fosforylering gemedieerde dimerisatie van het regulatorische PhoP domein essentieel is voor zijn transcriptiefunctie, vertrokken we van de hypothese dat de verstoring of stabilisatie van het proteïne-proteïne interactie in de dimeer interfase de expressie van PhoP regulerende genen kan beletten of verbeteren. In deze studie voerden we moleculaire dynamica simulaties uit op de actieve en inactieve (dimeer en monomeer) PhoP regulatorische domeinen. Met deze resultaten berekenden we: de vrije energie, zochten we naar holtes en een kwantitatieve hot-spot analyse om te bevestigen dat tegen het PhoP proteïne een medicijn kan ontwikkeld worden. We hebben twee geschikte en verschillende bindingsplaatsen met hot-spot zones in de dimeer actieve plaats (de $\alpha4-\beta5-\alpha5$ zone) geïdentificeerd en gebruikt in de structuur gebaseerde medicijn ontwikkeling. Deze resultaten toonden aan dat de dimeer interfase van het PhoP regulerende domein een attractief en geschikt doel is voor de ontwikkeling van kleine moleculen.

Om deze vooropgestelde bindingsplaatsen van het PhoP proteïne te bevestigen gebruikten we een virtueel doorlichtingsprotocol gecombineerd met pharmacophore  en docking gebaseerde methodes, dit om kleine moleculen te identificeren die mogelijk aan de doelplaats binden. Uit de resultaten van deze virtuele doorlichting werden een gelimiteerd aantal verbindingen geselecteerd. Deze werden aangekocht bij commerciële verkopers en biologisch gevalideerd met een GFP (Green-Fluorescent-Protein)-gebaseerde promotor fusie analyse. Vertrekkende van de positieve experimentele resultaten, chemische derivaten met mogelijk verbeterde activiteit, werden aangekocht en experimenteel getest met deze GFP analyse. Via deze methode werden verschillende nieuwe scaffolds gevonden die in staat zijn de transcriptiefunctie van het PhoP te moduleren, ofwel door activatie als remming van de expressie van PhoP regulerende genen. Deze nieuwe scaffolds kunnen de basis vormen voor de ontwikkeling van krachtigere nieuwe antimicrobiële medicijnen.

Samengevat: moleculaire dynamica simulaties werden gebruikt voor de studie van de dynamica en de proteïne-proteïne interacties van het PhoP proteïne en om een computationele bevestiging dat PhoP proteïne oppervlak een geschikte plaats is voor de ontwikkeling van medicijnen. Gebaseerd op deze studie hebben we computationele virtuele doorlichting methodes gecombineerd met experimentele analyse gebruikt om een reeks hit moleculen te identificeren. Deze nieuwe scaffolds kunnen gebruikt worden als startpunt voor de ontwikkeling van antimicrobiële medicijnen met een nieuw mechanisme welke minder antibioticaresistente fenotypes opwekken.

Datum:1 okt 2013 →  8 dec 2017
Trefwoorden:Rational drug design, Two component system, Protein-protein interactions
Disciplines:Biochemie en metabolisme, Systeembiologie, Medische biochemie en metabolisme
Project type:PhD project