Project
Gencorrectie voor het herstellen van splicing mutaties
Cystic fibrosis is een autosomaal recessieve ziekte die wordt veroorzaakt door mutaties in het CFTR-gen. Een aanzienlijk aantal mutaties (~ 13%) verandert de correcte splitsing van het CFTR-gen, waardoor de transcriptie van afwijkende transcripten resulteert in de productie van een niet-functioneel CFTR-kanaal. We richten ons onderzoek op twee intronische CF-veroorzakende mutaties, 3272-26A> G en 3849 + 10kbC> T, die respectievelijk een nieuwe acceptor- en donorsplitsingsplaats creëren, waarbij intronische delen in het mRNA worden opgenomen. We ontwikkelden een nieuwe benadering van genome editing om de bovengenoemde mutaties permanent te corrigeren door middel van CRISPR-nucleasen. We hebben gebruik gemaakt van het gebruik van Streptococcus pyogenes Cas9, SpCas9 of Acidaminococcus sp. BV3L6, AsCas12a, om de afwijkende splitsingsplaatsen te bewerken en de productie van het juiste transcript te herstellen, waarbij modificaties van de CFTR-coderingssequentie worden vermeden. Een vergelijkende analyse tussen SpCas9 en AsCas12a onthulde dat het gebruik van AsCas12a met een enkele crRNA efficiënt de doelloci bewerkt, waardoor correct gesplitste mRNA's worden geproduceerd in zowel 3272-26A> G- als 3849 + 10kbC> T-mutaties. Bovendien bleek deze genetische herstelstrategie zeer specifiek te zijn, met een sterke discriminatie tussen het gemuteerde en het wildtype allel en geen detecteerbare activiteit buiten het doelwit met genoombrede analyse. De geselecteerde crRNA's werden getest bij patiënten afgeleid van primaire luchtwegcellen en intestinale organoïden die heterozygoot zijn voor de 3272-26A> G- of 3849 + 10kbC> T-mutaties, die worden beschouwd als relevante CF-modellen voor translationeel onderzoek. Het efficiënte splitsingsherstel en het volledige herstel van de CFTR-kanaalactiviteit die werd waargenomen, bevestigden de goedheid van de voorgestelde genbewerkingsstrategie. Deze resultaten toonden aan dat allelspecifieke genoombewerking met AsCas12a afwijkende CFTR-splitsingsmutaties kan corrigeren, wat de weg vrijmaakt voor een permanente splitsingscorrectie bij genetische ziekten.