De rol van het aangeboren immuunsysteem in de pathogenese van systemische juveniele idiopathische artritis: verhelderende inzichten

Systemische juveniele idiopathische artritis (sJIA) is een ernstige auto-inflammatoire immuunziekte bij kinderen. Klinisch vertonen de patiënten koorts, huiduitslag, vergrote lymfeklieren, vergrote milt en/of lever en ontwikkelen ze uiteindelijk ook artritis. Hematologisch worden patiënten gekenmerkt door neutrofilie (inclusief een stijging van het aantal immature neutrofielen), leukocytose, anemie en trombocytose. Bij patiënten worden verhoogde cytokinespiegels in plasma gemeten voor interleukine‑6 (IL-6), IL-18, CRP en S100-eiwitten (S100A8/A9 en S100A12). Van alle JIA-subtypes heeft sJIA de hoogste mortaliteit aangezien de ziekte geassocieerd wordt met een ernstige en levensbedreigende complicatie: macrofaagactivatiesyndroom (MAS). MAS is een inflammatoir syndroom met overmatige activatie van macrofagen en T-cellen en resulteert uiteindelijk in een cytokinestorm. Verder wordt MAS ook geassocieerd met hemofagocytose. Recent werden bij patiënten met sJIA ook pulmonale complicaties vastgesteld waaronder interstitiële longziekte (ILD) en pulmonale alveolaire proteïnose (PAP).

In dit doctoraat wilden we de rol van het aangeboren immuunsysteem in de pathogenese van de sJIA beter begrijpen. Concreet wilden we inzicht krijgen in het succesvolle gebruik van IL-1-antagonisten bij patiënten, rekening houdend met het feit dat de IL-1β-bloedspiegels nauwelijks detecteerbaar zijn. Vervolgens wilden we de effecten van IL-1 op zowel de neutrofielen als de γδ T-cellen beter begrijpen. De aanmaak van neutrofielen (buiten het beenmerg) en hun rol in sJIA werden bestudeerd omwille van hun hoge aantal in de afwezigheid van enige infectie. Tot slot wilden we een antwoord vinden op de vraag waarom sJIA-patiënten ook longaandoeningen ontwikkelen. We vroegen ons af of dit eerder een bijverschijnsel is, of dat deze longontsteking daadwerkelijk ook een rol speelt bij het ontstaan van de ziekte.

Om deze vragen te beantwoorden, hebben we gebruik gemaakt van een beschreven muismodel voor sJIA dat gebaseerd is op de injectie van Compleet Freund's Adjuvant (CFA) in interferon-gamma (IFN-γ) knock-out (KO) muizen. Deze muizen ontwikkelen nagenoeg alle klinische en hematologische kenmerken die doen denken aan sJIA. Bij wildtype (WT) dieren resulteert CFA-immunisatie slechts in een gedeeltelijke immuunrespons. In dit onderzoek toonden we aan dat de verhoogde inflammatie in de geïmmuniseerde IFN-γ KO muizen toe te schrijven is aan verhoogde niveaus van actief caspase-1 en IL‑1β in de lymfoïde organen en het bloed. Dit zou ook de verhoogde vatbaarheid voor het ontwikkelen van sJIA kunnen verklaren in deze IFN-γ KO muizen. Met behulp van neutraliserende anti-IL-1β-antilichamen konden de kenmerkende ziektesymptomen van sJIA gedeeltelijk voorkomen worden. Behandelde muizen vertoonden namelijk minder gewichtsverlies, huiduitslag, granulocytose en trombocytose. Verder werden deze behandelde muizen ook gekenmerkt door verlaagde IL-6-spiegels in plasma. Overigens zagen we dat het aantal IL-17- en IL-22-producerende CD27-negatieve γδ T-cellen en CD4+ T-cellen was afgenomen na behandeling. Het gunstige effect van IL-17-depletie werd eerder al gerapporteerd in de eerste beschrijving van het muismodel. In dit doctoraat hebben we de rol van IL-22 in de pathogenese van sJIA verder onderzocht. Verhoogde plasmaspiegels van IL-22 werden gemeten in de CFA-geïmmuniseerde IFN-γ KO-muizen. Met behulp van een antilichaam dat IL-22 neutraliseert, toonden we een gedeeltelijke rol aan van IL-22 in het ziekteproces. Zo was neutralisatie geassocieerd met verminderd gewichtsverlies, staartschade, neutrofilie en trombocytose. Ook in actieve sJIA-patiënten werden verhoogde plasmaspiegels van actief IL-22 gemeten. Tenslotte, konden we met behulp van γδ T-cellen of CD4+ cellen van gezonde humane donoren aantonen dat IL-22 en IL-1β synergetisch de productie van IL-17 induceren.

Om de rol van neutrofielen in de pathofysiologie van sJIA te begrijpen hebben we gebruik gemaakt van anti-Ly6G (1A8) depleterende antilichamen. Deze antilichamen kunnen gebruikt worden om de in vivo rol van neutrofielen te bestuderen in muizenmodellen en worden aanzien als de gouden standaard omwille van hun specifieke depletiecapaciteit. Wij toonden echter aan dat toedienen van anti-Ly6G antilichamen de neutrofielen onvolledig depleteert in CFA-geïmmuniseerde muizen. Verder toonden we met BrdU-opname-experimenten aan dat depletie geassocieerd is met een verhoogde proliferatie in het beenmerg en een massale proliferatie van neutrofielen in de milt. Dit duidt aan dat de tijdelijke depletie gevolgd wordt door een snelle rebound van nieuwe immature neutrofielen die niet kunnen worden gedepleteerd. Daarom maakten we in ons onderzoek gebruik van een alternatieve aanpak waarbij we ons richtten op de granulocyt-kolonie-stimulerende factor (G-CSF). G-CSF is de belangrijkste groeifactor die betrokken is bij de proliferatie, rijping, vrijzetting en functionaliteit van neutrofielen. De aanmaak van G-CSF kan worden gestimuleerd door IL-17. Verhoogde plasmaspiegels van G-CSF werden gemeten in de CFA-geïmmuniseerde IFN-γ KO-muizen. Ook bij sJIA-patiënten worden verhoogde G-CSF-spiegels in plasma gemeten. Deze verhoogde concentraties werden gecorreleerd met ontstekingsmediatoren, waaronder het aantal neutrofielen en plasmaniveaus van IL‑6 of IL-1β. De rol van G-CSF werd bestudeerd in ons muismodel met behulp van een antilichaam dat de G-CSF-receptor (G-CSFR) blokkeert. We tonen aan dat G-CSF verantwoordelijk is voor de waargenomen neutrofilie en extramedullaire myelopoëse. Verder kon de ontwikkeling van artritis worden afgeremd wanneer we de G-CSFR blokkeerden. De behandelde muizen vertoonden echter ook een lichte verergering van enkele van de ziektesymptomen, waaronder gewichtsverlies, staartbeschadiging en het aantal immature rode bloedcellen. Ook werden licht verhoogde plasmaspiegels van IL-6, IL-17 en TNF-α gemeten. Single-cell sequencing toonde aan de ontwikkeling van neutrofielen in de milt gelijkaardig is als deze in het beenmerg en eveneens bestaat uit pre-neutrofielen, immature en mature neutrofielen. Wanneer WT en IFN-γ KO muizen werden vergeleken, werden deze laatste gekenmerkt door de ontwikkeling van immuun-onderdrukkende myeloïde suppressorcellen (MDSC’s). Aangezien G-CSFR blokkade resulteert in een verminderde maturatie en differentiatie van neutrofielen kan het verergerde fenotype in de IFN-γ KO muizen deels verklaard worden door het verlaagde aantal MDSC’s.

Rekening houdend met de recente longcomplicaties beschreven in sJIA-patiënten, werden de longafwijkingen bestudeerd in het sJIA muismodel. Met behulp van microcomputertomografie werd een milde vergroting gemeten van de longen na CFA-immunisatie, evenals een afname van de dichtheid van het luchtgedeelte. In de IFN-γ KO-muizen werd ook een verhoogde dichtheid gemeten van het niet-luchtgedeelte. Een afwijkende longfunctionaliteit werd gemeten in de CFA-geïmmuniseerde IFN-γ KO muizen. Deze waren verschillend bij mannelijke en vrouwelijke muizen. Mannetjesmuizen vertoonden een verhoogde weefselhysteresiviteit en weefseldemping, vrouwtjes daarentegen vertoonden een verhoogde hyperactiviteit van de luchtwegen. Vervolgens onthulde histopathologie subpleurale en parenchymale cellulaire infiltraten alsook de vorming van granulomen. Met behulp van flowcytometrie en kwantitatieve PCR toonden we een overmatige immuunactivatie aan met infiltratie van voornamelijk immature en mature neutrofielen of monocyten, verhoogde γδ-T-cellen, geactiveerde macrofagen en verhoogde expressie van zowel IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-17 als IL-22. Geassocieerd met deze verhoogde infiltratie van neutrofielen, werd ook een verhoogde expressie van G-CSF en neutrofiel-geassocieerde chemokinen gemeten in de CFA-geïnjecteerde IFN-γ KO-muizen. Alhoewel de pulmonale manifestaties bij muizen anders waren dan bij sJIA-patiënten, beklemtoont dit onderzoek het belang van longontsteking in de pathofysiologie van sJIA.

Neutrofielen werden verder onderzocht in twee auto-inflammatoire ziektes geassocieerd met IL-1β: pyrine-geassocieerde auto-inflammatie met neutrofiele dermatose (PAAND) en Familiale Middellandse zeekoorts (FMF). De twee aandoeningen worden veroorzaakt door verschillende mutaties in hetzelfde MEVV-gen. Gezien hun hoge aantal neutrofielen in het bloed en aangetaste weefsels, werden de neutrofielen transcriptioneel, functioneel en fenotypisch onderzocht. Op transcriptioneel niveau vertoonden patiënten een gedeeltelijk overlappend geactiveerd fenotype met verhoogde expressie van zowel S100-eiwitten, IL-4R, CD48, F5, MMP9 als NF-KB. Verhoogde concentraties van MMP9 en S100A8/A9 werden gevalideerd in het plasma. Flowcytometrische analyse toonde aan dat neutrofielen van FMF-patiënten een immatuur karakter hebben, een verhoogde expressie van TLR4 en TLR9 en een verlaagde expressie van CXCR2, C5aR en BLTR1. PAAND-patiënten vertoonden een verhoogde granulariteit en een verhoogde willekeurige migratie. De CXCL8-geïnduceerde migratie was echter gedaald. Ook de neutrofielen van FMF-patiënten vertoonden een verhoogde willekeurige migratie en verlaagde chemoattractant-geïnduceerde migratie. De neutrofielen van zowel FMF- als PAAND-patiënten vertoonden een verhoogde basale en TNF-α-geïnduceerde ROS-productie en hadden een verhoogde afgifte van het azurofiele granule-eiwit myeloperoxidase (MPO). Ten slotte toonden we aan de neutrofielen van PAAND-patiënten een verhoogde fagocyterende capaciteit hebben terwijl deze gedaald is bij FMF-patiënten. Concluderend kunnen we stellen dat PAAND en FMF-patiënten neutrofilaire afwijkingen vertonen die verschillend zijn ten opzichte van elkaar. Dit duidt op discrepantie tussen deze twee pyrine-geassocieerde ziektes.