Bone tissue engineering: De eigenschappen van periostale cellen variëren afhankelijk van hun oorsprong

Bottransplantaten worden vrijwel routinematig gebruikt in orthopedie, traumatologie, en orale en maxillofaciale chirurgie om botdefecten te behandelen die het gevolg zijn van trauma, chirurgische verwijdering van kwaadaardige tumoren, aangeboren afwijkingen, en prothetische behandelingen. Er zijn echter nog altijd beperkingen en complicaties verbonden aan de huidige standaard van het gebruik van autoloog botweefsel als transplantaten. Deze omvatten morbiditeit op de donorplaats, onvoldoende hoeveelheden beschikbaar donorweefsel, slechte ultieme weefselintegratie, en het risico op complicaties als gevolg van wegnamen van donorweefsel. Daarom is er behoefte aan alternatieve behandelingen voor botdefecten.

Botten hebben meerdere functies: ze bieden structuur, stabiliteit en mobiliteit met behoud van flexibiliteit via gewrichten, aan het lichaam. Het skelet beschermt ook inwendige organen, endocriene functies, en beenderen bevatten ook beenmerg. Botten bestaan uit compact corticaal bot en minder dichtmazig trabeculair botweefsel, die beide gemineraliseerd weefsel, botcellen en bot-omgevende cellen bevatten. Osteoblasten zijn verantwoordelijk voor het afzetten van collageen en het mineraliseren van het bot, terwijl osteoclasten betrokken zijn bij botresorptie. Botweefsel kan zich, afhankelijk van zijn locatie in het embryo en het adulte lichaam, via twee processen vormen, nl. intramembraneuze (IO) en endochondrale ossificatie (EO). IO behelst de differentiatie van skeletale stam- en voorlopercellen (SSPCs) in osteoblasten, wat leidt tot de afzetting van botmatrix en daaropvolgende vascularisatie. EO omvat de vorming van kraakbeen als intermediair weefsel, met SSPCs die differentiëren tot chondroblasten die kraakbeenmatrix produceren. De kraakbeencellen raken dan gezwollen en ondergaan dan vervolgens celdood en maken invasie van osteoprogenitorcellen en bloedvaten mogelijk, of ze transdifferentiëren tot osteoblasten. Lange botten worden voornamelijk gevormd door EO, en de genezing van botbreuken herhaalt dit proces.

Botweefsel engineering biedt een veelbelovende behandelingsoptie voor botdefecten. Het maakt gebruik van constructen die zijn samengesteld uit geschikte cellen, polypeptide groei- en differentiatiefactoren en een 3-D draagstructuur. De huidige benaderingen geven echter nog geen bevredigende resultaten voor gebruik in de kliniek. Er is nog altijd de noodzaak om de beste bron van progenitorcellen te selecteren, en deze efficiënt te combineren met biomaterialen en 3D draagstructuren, en idealiter kunnen de cellen efficiënt worden geëxpandeerd ex vivo met behoud van hun botvormende eigenschappen. Zowel natuurlijke als synthetische polymeren zijn overwogen voor deze 3D draagstructuren, en polypeptide groei- en differentiatiefactoren, zoals de been morfogenetische eiwitten (BMPs). Deze worden nu al gebruikt om celdifferentiatie van SSPCs tot botvormende cellen te bevorderen. BMPs zijn multi-potente embryonale en adulte cytokines die tevens effecten hebben in zachte weefsels, maar ook een rol spelen bij botvorming. BMP2 en BMP6 sturen cellen van het human beenvlies (hPDCs) naar botvorming. IO heeft beperkingen in botweefsel engineering, omdat er geen vascularisatie mee gepaard gaat, wat kan leiden tot weefselnecrose. EO, met het intermediair kraakbeenweefsel dat wordt gevormd en geadapteerd is aan een zuurstofarme omgeving, heeft veelbelovende resultaten opgeleverd voor botweefsel engineering. Craniofaciale botten, zoals die in het aangezicht en de kaken, hebben een andere embryonale oorsprong en botvormingsmechanisme dan lange botten. Craniofaciale botten tonen verschillen in celdelingssnelheid, expressie van osteoblast merkergenen, en hun potentie van weefselmineralisatie. Cellen die multi-potent zijn, zoals de SSPCs, worden vaak gebruikt voor botweefsel engineering vanwege hun proliferatie- en differentiatiecapaciteiten. SSPCs kunnen uit verschillende bronnen worden verkregen, waaronder beenmerg, vetweefsel, tandpulp, en periosteum.

              In dit doctoraatsproefschrift ligt de focus vooral op cellen uit het beenvlies (hPDCs) en ook op de bot-bekledende cellen in de maxillaire sinus, en op hun potentieel voor botweefselherstel in combinatie met bot bevorderende factoren en bot ondersteunende draagstructuren. Deze studie combineert expertise van hPDCs, biomaterialen, systeembiologie en transcriptomics om de hPDCs te karakteriseren en te exploreren voor toekomstig gebruik in de kliniek. In het eerste deel van deze thesis worden hPDCs respectievelijk geïsoleerd uit verschillende craniofaciale locaties (met name boven- en onderkaak) en uit het onderbeen. Onze hypothese hierbij was dat deze cellen intrinsieke verschillen en een verschillend botvormend potentieel hebben. Wij tonen aan dat de celdelingscapaciteiten van elk van die hPDCs vergelijkbaar zijn, maar hun transcriptoom, inbegrepen genen die betrokken zijn bij de skeletontwikkeling, verschilt. Stringente in vivo testen voor de novo botvorming tonen aan dat de mandibulaire hPDCs - zowel in celcultuur als in vivo – een sterk differentiatiepotentieel hebben naar kraakbeen- en botweefsel door EO.

In een apart, kleiner project onderzochten we eveneens cellen van het Schneider-membraan, dit zijn botbeklede cellen die worden aangetroffen in de sinus van de bovenkaak. Niettegenstaande deze cellen goed delen en in celcultuur differentiëren naar kraakbeen- en botvormende cellen, zijn ze in vivo minder succesvol in botvorming in vergelijking met hPDCs van de onderkaak en het onderbeen. Een ander, afzonderlijke ambitie was om onze celcultuurmedia met foetaal runderserum (FBS) te vervangen door een dierproduct-vrij medium. Daarom werden chemisch gedefinieerde media (CDM) en medium aangevuld met humaan bloedplaatjeslysaat (hPL) getest. De CDM die voor dit proefschrift werd uitgeprobeerd, liet geen succes zien door de aanzienlijke celdood, maar de vervanging van FBS door hPL leidt tot verbeterde differentiatie richting bot in celcultuur en meer gemineraliseerd botweefsel in vivo.

Het volgende doel van dit doctoraatsonderzoek was om botvormende eigenschappen in vivo te verbeteren door hPDCs van de onderkaak te stimuleren met BMPs en deze cellen dan op 3D draagstructuren uit te zaaien en te gebruiken in transplantatie. Ons onderzoek toont aan dat stimulatie met BMP2 meer uitgesproken effecten oplevert met betrekking tot de productie van genen die geassocieerd zijn met de ontwikkeling van het skeletstelsel, in vergelijking met BMP6. Van de geteste draagstructuren laat CopiOs de meest veelbelovende resultaten zien met betrekking tot botvorming. Verder werd een rattenmodel ontwikkeld voor een kritisch-groot botdefect in de onderkaak, waarin het celconstruct bestaande uit hPDCs van de onderkaak, gestimuleerd met BMP2 en gezaaid op een CopiOs-draagstructuur, getest kon worden op zijn botherstellend vermogen in een relevante context.

Alles samen draagt dit doctoraatsonderzoek bij tot het gebied van cranio-maxillofaciaal botherstel door het potentieel van hPDCs te onderzoeken, verschillende celbronnen en kweekomstandigheden te onderzoeken, en het gebruik van BMPs en draagstructuren voor verbeterde botvorming te optimaliseren.