Karakterisatie van VASA-expresserende cellen, afkomstig van humane embryonale stamcellijnen. (FWOKN205)

Uiteenzetting van het voorgestelde project Recent werden mannelijke en vrouwelijke gameten afgeleid van muriene embryonale stamcellen (mESC) (Hübner et al., 2003; Toyooka et al., 2003; Geijsen et al., 2004; Nayernia et al., 2006). Hoewel het onderzoek naar de differentiatie van humane embryonale stamcellen (hESC) tot gameten nog zeer jong is, wordt verwacht dat hESC een vergelijkbare differentiatiecapaciteit bezitten. In de mens is de expressie van VASA beperkt tot de kiemcellen, beginnend in migrerende primordiale kiemcellen tot en met de spermatiden en eicellen (Castrillon et al., 2000). In tegenstelling tot vroegere kiemcelmerkers, zoals DAZL en POU5F1, komt VASA niet tot expressie in hESC, waardoor het een goede merker is voor kiemceldifferentiatie vanuit hESC. Onze onderzoeksgroep slaagde er recent in om verhoogde expressie van VASA teweeg te brengen via een gerichte differentiatie van humane embryonale stamcellen (artikel in voorbereiding). Hierbij werd gebruik gemaakt van twee verschillende differentiatie protocols die werken via een 'embryoid body' aanpak. In het eerste protocol worden bone morphogenetic proteins 4, 7, 8b en 2 (BMP) toegevoegd aan het standaard differentiatiemedium; het tweede protocol maakt gebruik van ditzelfde standaard differentiatiemedium dat door een muriene Sertolicellike cellijn geconditioneerd werd. Dit onderzoek betekende een eerste stap in onze kennis over de differentiatie capaciteit van hESC tot primordiale kiemcellen en gameten. In een volgende stap is het belangrijk om deze VASA-expresserende cellen, afkomstig van hESC te karakteriseren. In een eerste stap willen we de proteïne expressie van de cellen bestuderen. Hiervoor willen we antilichamen gebruiken tegen VASA, POU5F1, C-KIT en SCP-3. Deze proteïnen komen op verschillende momenten tijdens de kiemceldifferentiatie tot expressie en het combineren van de verschillende expressiepatronen kan een inzicht geven in welk stadium van differentiatie de cellen zich bevinden. Zo komt POU5F1 tot expressie van de premigratoire tot de migratoire primordiale kiemcellen (PGCs); start de expressie van VASA en C-KIT in de migratoire primordiale kiemcellen en kan SCP-3 pas gedetecteerd worden in post-migratoire PGCs, als merker van de meiose (Clark et al., 2004). De proteïne-expressie zal geanalyseerd worden door middel van dubbelkleuringen met verschillende combinaties van de 4 antilichamen, in combinatie met fluorochroom-gelabelde secundaire antilichamen, zodat visualisatie met behulp van een confocale microscoop mogelijk is. Als tweede belangrijke karakterisatiestap willen we de methylatiestatus van enkele genen onderzoeken door middel van bisulfiet behandeling en pyrosequencing. Tijdens de gametogenese wordt de DNA-methylatie van de cellen uitgewist en, in functie van het geslacht, ontstaat er een nieuw imprintingspatroon in de gameten (Allegruci et al., 2005). Wij willen nagaan of deze algemene demethylatie optreedt tijdens de differentiatie van hESC naar VASA-expresserende cellen. Hiervoor willen we, naast de methylatie van enkele 'normale' genen, ook de methylatie van de geïmprintte Igf2/H19 locus op de BWS (Beckwith-Wiedemann Syndroom) cluster (chromosoom 11) onderzoeken (Weksberg et al., 2003). De combinatie van de proteïne-expressie en de methylatiestatus van de in vitro gedifferentiëerde humane embryonale stamcellen, moet ons in staat stellen om vrij nauwkeurig de differentiatie status van deze cellen te bepalen. Bovendien zullen we hierdoor een duidelijk beeld krijgen van de differentiatie capaciteit van hESC naar gameten.

Trefwoorden:reproductive genetics, andrology, clinical genetics, embryology, assisted reproductive technology

Disciplines:Basiswetenschappen, Biologische wetenschappen