Ontwikkeling van multiplex bioassays met specifiek georiënteerde bioreceptoren op een FO-SPR platform

Binnen de grote waaier aan biosensoren die tegenwoordig beschikbaar zijn, zijn biosensoren gebaseerd op  oppervlakteplasmonresonantie (SPR) de gouden standaard voor het  opvolgen van biomoleculaire interacties. Deze technologie wordt dan ook op grote schaal gebruikt voor klinische diagnostiek, biologische en farmaceutische analyses en de evaluatie van voedselkwaliteit en -veiligheid. Het ontwerp van slimme bioherkenningslagen en, in het bijzonder, de georiënteerde afzetting van bioherkenningsmoleculen op het sensoroppervlak is, mede dankzij de snelle vooruitgang van de afgelopen jaren, een van de belangrijkste innovatietrends in SPR-biosensoren geweest met als doel de detectieprestaties te verbeteren. Om een gecontroleerde oriëntatie te bereiken bij het afzetten van eiwitten die optreden als bioherkenningsmoleculen, kan nitrilotriazijnzuur (NTA)-chemie worden toegepast in combinatie met His6-gelabelde biomoleculen. De instabiliteit van de gecoördineerde covalente binding tussen het His6-gelabelde bioherkenningsmolecule en het NTA-chelaat belemmert echter de toepasbaarheid ervan voor metingen in complexe staalmatrices. Om deze beperking te overwinnen, werd kobalt Co3+ geïntroduceerd als het ion dat optreedt als bemiddellaar tussen het NTA en de His6-gelabelde eiwitten, waardoor een stabieler en inert gefunctionaliseerd oppervlak wordt gecreëerd. Deze Co(III)-NTA-chemie werd reeds toegepast en gevalideerd in verschillende biosensorplatformen, waaronder kwartskristalmicrobalans-, interferometrische  en fluorescentiesensoren, maar werd tot nog toe niet onderzocht voor SPR-biosensoren.

Het doel van dit proefschrift was dan ook om een innovatieve benadering op basis van Co-NTA-oppervlaktechemie te ontwikkelen voor de georiënteerde afzetting van bioherkenningsmoleculen op een glasvezel (FO)-SPR biosensor, en zo nieuwe FO-SPR bioassay-concepten (bijv. meervoudige detectie, regeneratie, enz.) voor diverse biomedische toepassingen te ontwikkelen. FO-SPR is een veelbelovend alternatief voor de conventionele chip-gebaseerde SPR vanwege het gebruiksgemak, de lage consumptie van staal, de directe detectie in complexe staalmatrices en goedkope sensorsondes. Na meer dan een decennium van voortdurende inspanningen werd een intern geassembleerd FO-SPR-biosensorprototype met succes gecommercialiseerd door een spin-off bedrijf (FOx Biosystems) van de Biosensorengroep van KU Leuven. Dit toestek werd tijdens dit doctoraat gebruikt als  biosensorplatform.

Eerst en vooral hebben we Co(III)-NTA-chemie geïmplementeerd op het FO-SPR-platform. Wanneer vergeleken met de traditionele EDC/NHS-chemie, resulteerde NTA in (1) een efficiëntere oppervlaktedekking met bioherkenningsmoleculen en (2) de realisatie van labelvrije bioassays in buffer en verdund menselijk plasma. Bovendien bleek het Co(III)-NTA-oppervlak verenigbaar met sandwich-bioassays gebaseerd op gouden nanodeeltjes (AuNP's) en dit in buffer en verdund menselijk plasma, waardoor de gevoeligheid aanzienlijk werd verbeterd. Dit benadrukte het belang van Co(III)-NTA ter bevordering van de georiënteerde en stabiele patroonvorming van bioherkennings-moleculen voor het realiseren van gevoelige bioassays in complexe matrices, zowel in labelvrije als gelabelde vorm.

Omdat oppervlakteherbruikbaarheid één van de interessante aspecten op het gebied van SPR is, hebben we hier een benadering ontwikkeld om het FO-SPR-oppervlak te regenereren met behulp van Co(II)- in plaats van Co(III)-NTA-chemie, waardoor verbreking van het NTA-chelaat mogelijk wordt. De ware veelzijdigheid van deze aanpak werd bewezen door oppervlakteregeneratie gedurende 10 cycli met 4 verschillende His6-gelabelde bioherkenningsmoleculen. Deze snelle en kosteneffectieve manier van oppervlakteregeneratie heeft  brede toepassingen variërend van de ontwikkeling van biosensoren en verschillende biofarmaceutische analyses tot de synthese van nieuwe biomaterialen.

Door gebruik te maken van NTA-chemie voor een efficiënte oppervlaktefunctionalisatie, hebben we voor het eerst een innovatief multiplexconcept ontwikkeld voor gelijktijdige detectie van 2 doelwitmoleculen met eenzelfde FO-SPR-sonde. Co(III)-NTA-chemie werd gebruikt voor sequentiële afzetting van 2 verschillende His6-gelabelde bioherkenningsmoleculen, terwijl AuNP's een cruciale rol speelden om doelsignalen te onderscheiden en te versterken. Verrassend genoeg ontdekten we dat een concentratie aan bioherkenningsmoleculen lager dan diegene nodig voor het bereiken van oppervlakteverzadiging tot een optimale detectie leidde. Ten slotte hebben we het multiplex-bioassay in zowel buffer als verdund menselijk plasma ontwikkeld en de toepasbaarheid ervan bewezen voor het kwantificeren van doelwitmoleculen in willekeurige verhoudingen.

Gedreven door de aanhoudende coronaviruspandemie (COVID-19), hebben we Co(III)-NTA-chemie eveneens toegepast voor het ontwikkelen van een serologische test op het FO-SPR-platform. In deze context gebruikten we de FO-SPR-labelvrije bioassays niet enkel voor kwantificering maar ook voor het identificeren van het profiel van de bindingskinetiek van de volledige polyklonale antilichaamrespons tegen SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2), wat onmogelijk te realiseren is met traditionele serologische tests. Dit werd uitgevoerd  in patiëntenserum en, voor de eerste keer, direct in onverdund bloed. Het ontwikkelde bioassay was (1) vergelijkbaar met FO-SPR-sandwich-bioassays wat betreft het onderscheiden van COVID-19 van controlestalen, ongeacht het type staalmatrix, en (2) sneller dan de FO-SPR-sandwich-bioassay en conventionele ELISA. Ten slotte onthulde deze benadering geen directe correlatie tussen antilichaamniveaus en hun kinetische profielen, een extra bewijs om eerdere hypothesen te ondersteunen dat antilichaambindende kinetiek tegen het antigeen in het bloed van patiënten een rol zou kunnen spelen bij de ernst van COVID-19.

Samenvattend hebben we meerdere innovatieve bioassays ontwikkeld op het FO-SPR-platform met behulp van Co(III)- en Co(II)-NTA oppervlaktechemie. Het toepassen van 6 verschillende modelsystemen en 3 verschillende staalmatrices (d.w.z. plasma, serum en bloed) hebben de robuustheid van de bioassays duidelijk aangetoond en het repertoire van FO-SPR-toepassingen in medisch diagnostiek en biowetenschappen verder uitgebreid.