Ontwikkeling en optimalisatie van super-resolutie biosensoren compatibel met super-resolutie optische fluctuatie beeldvorming

Het leven is dynamisch, gedefinieerd door het vermogen om homeostase te handhaven in een steeds veranderende omgeving. Op cellulair niveau vereist dit een ingewikkeld regulatorisch netwerk om activiteiten en reactiviteiten te controleren als reactie op externe prikkels. Fluorescentiemicroscopie kan fungeren als een venster op deze wereld van dynamische subcellulaire activiteiten. De complexe spatiotemporele regulatie van deze netwerken kan worden onderzocht met fluorescente indicatoren, opmerkelijke moleculen waarvan de fluorescentie-emissie afhangt van de aanwezigheid van een specifieke stimulus. Er wordt echter aangenomen dat compartimentering op nanoschaal een belangrijke rol speelt bij het vormgeven van deze dynamische architecturen, en momenteel blijft kwantitatieve observatie van dynamische gebeurtenissen op deze kleinste schaal een uitdaging. 

In dit proefschrift beschrijven we nieuwe methodologieën die gebruik maken van deze voorwaardelijke fluoroforen om dynamische activiteiten op de nanoschaal te observeren en te manipuleren. Eerst bespreken we onze visie op de mogelijkheden en de valkuilen voor genetisch geëncodeerde biosensoren, inclusief potentiële uitdagingen voor hoge resolutie biosensing. De specifieke uitdagingen voor ratiometrisch Förster resonance energy transfer biosensing worden uitgebreid in het volgende hoofdstuk, waar we simulaties gebruiken om onechte structurering te benadrukken die ontstaat door een wanverhouding in resolutie bij meerkleurige beeldvorming. Vervolgens beschrijven we een correctiestrategie gebaseerd op de optische overdrachtsfuncties van beide kleurkanalen om meerkleurenbeelden kwantitatief vergelijkbaar te maken. Deze strategie wordt vervolgens toegepast op biosensing van mitochondriale proteïne kinase A activiteit in een proof-of-concept experiment.
In het laatste hoofdstuk laten we zien dat de combinatie van fluorescente indicatoren en biologische nanoporiën gebruikt kan worden om compartimentering op nanoschaal te creëren. Door een nanoporie als een elektrisch gecontroleerde klep te gebruiken, zijn we in staat om reactievolumes op nanoschaal te creëren met een activeringstijd van minder dan een milliseconde. We bevestigen dat het reactievolume nauwkeurig gemanipuleerd kan worden en leveren bewijs voor het submilliseconde schakelen van de nanoporie, waardoor het kleinste snel regelbare reactievolume tot nu toe wordt gegenereerd.