< Terug naar vorige pagina

Project

Het vangen van het viral genoom om S genen te identificeren in Brachypodium distachyon gerst en tarwe

 

Als gevolg van de wereldwijde coronapandemie heeft iedereen de directe impact van een virale epidemie op de menselijke gezondheid ervaren. Het wordt echter vaak onderschat dat vergelijkbare gevolgen kunnen optreden wanneer gewassen in plaats van mensen gastheren worden van ziekteverwekkers. Tot 40% van de wereldwijde opbrengstverliezen worden toegeschreven aan ziekten veroorzaakt door pathogenen, wat resulteert in een jaarlijkse economische kostenpost van meer dan 220 miljard dollar. Effectief managment van virale ziekten is essentieel om de gewasproductiviteit per oppervlakte-eenheid te verhogen en het landgebruik te optimaliseren.

Deze thesis richt zich op de introductie van virale resistentie in planten. Virussen, met hun compacte genoom, maken gebruik van plant-specifieke eiwitten om een succesvolle infectie tot stand te brengen. We noemen deze provirale factoren susceptibilitieisfactoren (S-factoren), omdat hun aanwezigheid zorgt voor een compatibele virus-plantinteractie. Bijgevolg kan door het uitschakelen van deze factoren de compatibiliteit tussen de plant en het virus worden aangetast, wat leidt tot virale resistentie. RNA speelt een centrale rol in het infectieproces van enkelstrengige positief-sense RNA-virussen. Het is dan ook niet verwonderlijk dat het virale RNA fysiek interageert met een veelheid aan plant-eigen RNA-bindende eiwitten (RBPs) om kritieke stappen voor succesvolle infectie te faciliteren, zoals translatie, verpakking, lokalisatie, enzovoort. Het identificeren van de interactie tussen viraal RNA en gastheereiwitten kan resulteren in een lijst van interessante doelwitten voor antivirale strategieën.

In de afgelopen jaren zijn talrijke technieken ontwikkeld om RNA-eiwitcomplexen (RNPs) te bestuderen, zoals RIC, CARIC, RICK, TRAPP, VIR-CLASP, ChiRP-MS, CHART-MS en RAP-MS. Ondanks de momenteel beschikbare set technieken zijn naar ons weten slechts een paar interactomen van specifieke RNA-soorten geïdentificeerd. Voor planten was zelf nog geen specifiek RNP-isolatieprotocol beschreven. We geloven dat technische beperkingen, opbrengst, zuiverheid en hoge experimentele kosten van eerdere procedures voorkomen dat ze routinematig worden gebruikt. We hebben de oorsprong van deze moeilijkheden geïdentificeerd en bestaande benaderingen gecombineerd om deze uitdagingen te overwinnen.

We hebben een nieuwe methodologie ontwikkeld genaamd SAPS-capture voor de opzuivering van specifieke RNPs. Deze aanpak omvat een silica-gebaseerde isolatie van RNA en RNPs gevolgd door een organische fasen scheiding om alle RNPs specifiek te isoleren. Vervolgens wordt een specifiek RNP  geïsoleerd door gebruik te maken van antisense biotinylated probes. Door de opzuivering van de RNPs voorafgaand aan de specifieke RNP-isolatie, hebben we significante verbeteringen gebracht inzage de kosten, schaalbaarheid en bufferflexibiliteit in vergelijking met bestaande protocollen. We hebben onze methode gevalideerd door een goed gekarakteriseerd complex te isoleren, namelijk 18S ribosomale RNPs in bakkersgist. Het uitvoeren van het protocol met voorafgaande kennis van de verwachte uitkomst stelde ons in staat de specificiteit van de procedure te beoordelen. Na het SAPS-capture-proces vonden we dat 80% van de significant verrijkte eiwitten inderdaad interactors van het ribosomale RNA waren, wat de effectiviteit van de methode bevestigde.

Om de toepasbaarheid van het protocol uit te breiden naar meer uitdagende stalen, zoals plantmateriaal, hebben we het SAPS-gedeelte van het protocol aangepast voor Arabidopsis thaliana. Dit omvatte het aanpassen van de lysisbuffer en het verbeteren van de UV-cross-linking-procedure om efficiënt hele weefsels te cross-linken. Gezien onze overtuiging van de organisme-onafhankelijke aard van de SAPS-output, moedigde het succesvol isoleren van een plant-RNA-bindende proteoom in A. thaliana ons vertrouwen in de bredere toepasbaarheid van de gehele SAPS-capture-procedure voor planten aan.

Het intern ontwikkelde SAPS-capture werd vervolgens toegepast om virale RNPs op te zuiveren voor de identificatie van S-factoren die betrokken zijn bij Tobacco rattle virus-infectie (TRV) in Nicotiana benthamiana. Onze analyse identificeerd aanrijking van drie virale eiwitten en een verrijking van nucleotide-bindende eiwitten. Dit was een positieve controle voor het protocol. Bovendien identificeerden we 36 interactiepartners van het virale RNA, die we momenteel aan het valideren zijn. Met andere woorden, we onderzoeken of het uitschakelen van deze genen resulteert in een significante vermindering van virale replicatie. Hoewel de eerste screening van de T1-generatie veelbelovende resultaten opleverde, vereist het gebrek aan genetische uniformiteit verdere validatie in replicaat met behulp van stabiele knock-outlijnen. Aangezien S-factoren vaak worden beschouwd als breed-spectrum resistentiefactoren, zouden deze bevindingen in de toekomst mogelijks kunnen worden vertaald naar tomaten en aardappelen, die tot dezelfde plantenfamilie behoren als N. benthamiana en vatbaar zijn voor virussen die verwant zijn aan het Tabaksratelvirus.

 

Datum:30 okt 2019 →  31 okt 2023
Trefwoorden:virology
Disciplines:Virologie
Project type:PhD project