Nieuwe inzichten in de farmacologische inhibitie en isovormspecifieke regulatie van Proteine Kinase D2

Proteïne kinasen zijn essentieel voor het leven. Ze katalyseren de fosforylering van hun substraten, waardoor ze de functie hiervan kunnen veranderen. De dysregulatie van kinasen is geassocieerd met meerdere aandoeningen, waaronder kanker, en ze zijn vaak doelwitten voor remming met kleine moleculen.
In dit manuscript hebben we onderzoek gedaan naar de Proteïne Kinase D (PKD) familie.
Deze familie behoort tot de Calmodulin kinase (CAMK) groep en bestaat uit drie isoenzymen bij mensen. Terwijl de isoenzymen structureel sterk vergelijkbaar zijn, zijn ze niet altijd functioneel redundant, en soms hebben de isoenzymen zelfs een tegenovergestelde rol. De moleculaire basis voor deze isoenzyme-specifieke functies is in veel gevallen niet goed begrepen.
PKD's worden klassiek geactiveerd via signaleringstrajecten geïnitieerd stimulatie van G-eiwit gekoppelde receptoren of receptor tyrosine kinasen, waardoor er diacylglycerol wordt gevormd. Daarnaast worden ze ook geactiveerd in oxidatieve stress. Een interessante vondst in deze thesis is dat de regulatie van PKD isoenzymen in oxidatieve stress sterk verschilt. Een belangrijk verschil is de PKD2 specifieke Abl-gemedieerde fosforylering van een sterk geconserveerd Tyr-residu in de P + 1-lus (d.w.z. de substraatbindingslus) van het activatiesegment. Fosforylering van dit aminozuur gebeurt specifiek in PKD2 door een Abl herkenningsmotief dat verschilt tussen PKD1/2/3. Fosforylering van dit Tyr residu resulteert in hogere substraat omzetting door PKD2.
Daarnaast hebben we ook isovormspecifieke signalering gezien naar NF-κB in oxidatieve stress, maar dit was onafhankelijk van Tyr fosforylering in de P + 1 lus.
Terwijl Tyr-fosforylering in de P + 1-lus van PKD2 afhankelijk is van stroomopwaartse kinasen in cellen, kunnen PKDs (alle isovormen) dit residu verrassend genoeg in vitro autofosforyleren.
In cellen heeft PKD deze activiteit niet. Dit komt doordat PKD's associëren met een autofosforylatie-remmende factor in cellen die Tyr autofosforylering verbiedt. Interessant genoeg tonen we aan dat de moleculaire determinanten voor Tyr autofosforylering verschillen van die voor Ser-autofosforylering en transfosforylering van peptide. Bovendien tonen we aan dat Tyr autofosforylatie activiteit afhankelijk is van de aanwezigheid van een ongewoon Cys residu in het HxD motief van de katalytische lus. Dit residu is een Arg in de meeste kinasen, maar wordt vaak gesubstitueerd in dual-specificity kinasen.
Door de rol die PKD isovormen spelen in kanker, waren we ook geïnteresseerd in de ontwikkeling van PKD-remmers.
In dit opzicht zijn grote PP1-analogen (bijvoorbeeld 1-NM-PP1), die normaal geen wild-type kinasen binden door structurele botsingen met het 'gatekeeper'-aminozuur, een interessant beginpunt voor het rationele ontwerp van een sterke PKD-remmer, aangezien deze moleculen onverwachts toch wild type PKDs remmen. Onze structuur-activiteit relaties (SAR) studies van 1-NM-PP-1 derivaten onthulde een ongewone bindingswijze van dit type remmers aan PKD en resulteerde in de ontwikkeling van de meest actieve verbindingen van deze klasse tot nu toe. Deze gegevens geven dus nieuwe inzichten voor de mogelijke ontwikkeling van toekomstige PKD-specifieke verbindingen.