Inzicht in de pathogenese van gamma-herpesvirus en de ontwikkeling van nieuwe behandelingsstrategieën.

Tot op heden zijn er twee gekende humane γ-herpesvirussen, het Epstein-Barr virus (EBV) en het Kaposi-sarcoma geassocieerd virus (KSHV). EBV is het eerst beschreven in 1964 in een weefsel van endemisch Burkitt-lymfoom. De eerste beschrijving van Kaposi sarcomen dateert van 1872, hoewel slechts in 1994, KSHV was erkend als de oorzaak van de ziekte.

Een primaire EBV is het meest gekend om infectieuze mononucleose (klierkoorts) te veroorzaken bij jongvolwassenen en volwassenen. Een KSHV primaire infectie is minder goed gedefinieerd en de symptomen zijn onder andere koorts, lymfadenopathie en macupapulaire uitslag. Bij immuuncompetente individuen, volgt er na de initiële infectie een evenwicht tussen het immuunsysteem en het virus, met overleving van het virus maar zonder ziekteverschijnselen. Dit is niet het geval bij immuungecompromitteerde patiënten, waarbij een latente infectie geassocieerd wordt met de ontwikkeling van verschillende lymfoproliferatieve aandoeningen en epitheliale/endotheliale kankers.

Door de hoge impact van γ-herpesvirus geassocieerde aandoeningen, is er nood aan meer basisonderzoek aangaande de humane γ-herpesvirussen, maar ook aan nieuwe therapeutische strategieën zoals de ontwikkeling van vaccins, virus-specifieke kankerbehandelingen en antivirale middelen. Het gebrek aan EBV- en KSHV-gerichte behandelingsstrategieën kan worden toegeschreven aan het ontbreken van een in vitro celcultuur systeem dat efficiënte virale replicatie toestaat. Om dit probleem op te lossen worden γ-herpesvirussen vaak bestudeerd door het gebruik van surrogaat virussen zoals het murine γ-herpesvirus-68 (MHV-68). In deze thesis worden verschillende aspecten van γ-herpesvirus antivirale middelen onderzocht. Gebruikmakend van MHV-68, onderzochten we antivirale resistentie ontwikkeling tegen zowel gekende nucleoside, nucleotide als pyrofosfaat analogen, en evalueerden de impact van geneesmiddel-resistente virussen op de γ-herpesvirus virale replicatie. Daarnaast werden er verschillende factoren geïdentificeerd die de activatie van nucleoside analoog cyclisch-HPMPC, kunnen beïnvloeden door gebruik te maken van verschillende EBV-geïnfecteerde B-cellijnen afkomstig van Burkitt-lymfomen.

Eerst, onderzochten we de impact van specifieke mutaties in MHV-68 virale thymidine kinase (TK) of proteïne kinase (PK) op de virale replicatie capaciteit. De mutaties in dit hoofdstuk, zijn in voorafgaand onderzoek in ons laboratorium geïdentificeerd. De virale replicatie capaciteit werd bepaald door wild-type en geneesmiddel-resistente virussen samen te laten groeien in de afwezigheid of aanwezigheid van verschillende antivirale middelen (dubbele infectie competitietesten), waarbij de samenstelling van de gemengde virale populatie werd bepaald door next-generation sequencing.

Daarna, werd het resistentiemechanisme onderzocht van MHV-68 tegen bepaalde nucleoside (ganciclovir), nucleotide (cidofovir, HPMP-5azaC, HPMPO-DAPy) en pyrofosfaat (foscarnet) analogen en werd de impact van deze geneesmiddel-resistente mutaties gelokaliseerd in het virale DNA polymerase (DP) op de virale replicatie capaciteit geëvalueerd. Twee geneesmiddel-resistente virale isolaten, gelinkt aan de DP aminozuur veranderingen C297W en C981Y, werden geïdentificeerd als virussen met een verlaagde replicatiefideliteit (mutator fenotype virussen). Het mutator fenotype veroorzaakt door aminozuurverandering C297W werd gevalideerd door gebruik te maken van CRISPR/Cas9 genome editing.

Tenslotte, in het derde hoofdstuk evalueerden we het effect van een enkel-nucleotide polymorfisme die aanleiding geeft tot de heterozygote aminozuurverandering Q207R op het vermogen van het cellulair 2',3'-cyclisch-nucleotide 3'-fosfodiesterase (CNPase) om cyclisch-HPMPC te metaboliseren. Daarnaast identificeerden we een verband tussen expressie van EBV latente proteïnes en CNPase proteïne expressie en vermogen om cyclisch-HPMPC te metaboliseren. CNPase is deel van de 2′,3′-cAMP-adenosine pathway en katalyseert in vitro de omzetting van nucleoside 2′,3′-cyclisch monofosfaten naar nucleoside 2′-monofosfaten. Echter, in vivo is de functie van het cellulair CNPase grotendeels onbekend en het fysiologisch substraat is nog niet bepaald. Hiernaast stelden we vast dat de Jiyoye cellijn niet homogeen is doordat deze een subpopulatie bevat met een gewijzigd latentie type, veroorzaakt door een 14 kb deletie van het virale genoom, en die geïntegreerd is in het cellulaire genoom.

Aangezien geneesmiddelen-resistentie inherent is aan virussen, is onderzoek naar antivirale resistentie en de impact van resistentie op virale fitness cruciaal. Onze resultaten stelde ons in staat om mutatie patronen tussen verschillende herpesvirussen te vergelijken en zorgden voor een dieper begrip van de impact van resistentie en antivirale druk op virale fitness. Daarenboven toonden we aan hoe cellulaire en/of virale factoren de activatie van cyclische prodrugs kunnen beïnvloeden.