< Terug naar vorige pagina

Publicatie

Proline-specific enzymes in infection and inflammation

Boek - Dissertatie

In dit doctoraat werden een aantal proline-specifieke enzymen van de dipeptidyl peptidase (DPP)-familie bestudeerd, zijnde DPP4, fibroblast activation protein ? (FAP), DPP8 en DPP9. Deze enzymen knippen preferentieel hun substraten na een proline als deze op de voorlaatste plaats staat aan de N-terminus. Dit doctoraatsonderzoek was tweeledig. Enerzijds werd er getracht om humaan DPP8 en DPP9 recombinant aan te maken, om voldoende voorraad te hebben voor verder onderzoek. Anderzijds werden er ook enkele functionele aspecten van deze enzymen bekeken. Hiervoor werden DPP4 en FAP onderzocht in bloedstalen van patiënten met septische shock (gedefinieerd volgens sepsis-2) op dagen 1, 3, 5 en 7 om na te gaan of ze als biomerker kunnen dienen voor diagnose of prognose en of er associaties zijn met sepsis-gerelateerde parameters. Daarnaast werd een anti-inflammatoir effect gemeld van de DPP8/9-inhibitor 1G244 op humane en muriene macrofagen. Bovendien induceerde deze inhibitor ook celdood in de J774 cellijn. Echter is het niet geweten hoe deze inhibitor deze effecten bewerkstelligt. Er werd getracht om deze achterliggende mechanismen te ontcijferen. DPP8 en DPP9 werden succesvol tot expressie gebracht en opgezuiverd uit insectcellen. De identiteit van de enzymen werd bevestigd met behulp van PCR, western blot en enzymatische activiteitsmetingen. Bovendien werden hun kenmerken geëvalueerd door hun pH-profiel, de Km- en kcat-waarden van Gly-Pro-pNA en Gly-Pro-AMC en de IC50-waarden voor 1G244 en Val-boroPro te bepalen. Deze experimenten leverden resultaten op binnen de verwachtingen. Zowel DPP4 als FAP waren significant lager in de septische shock patiënten in vergelijking met een ICU controle groep en dit voor alle dagen. ROC-curves gaven AUC-waarden voor FAP van 0,94 (CI: 0,89-0,99) en voor DPP4 van 0,86 (CI: 0,77-0,95). Een beperkte associatie werd gezien tussen DPP4 en overleving op dag 90. Een hogere DPP4-activiteit ging gepaard met een toename van de overleving. Deze resultaten tonen aan dat FAP en DPP4 verder moeten worden onderzocht als mogelijke diagnostische (en voor DPP4 ook als prognostische) biomerkers. Om de mechanismen achter de effecten van de DPP8/9-inhibitor te ontcijferen werd er gekeken naar de mogelijke betrokkenheid van kinasen met behulp van het PamGene kinomics platform. In primaire muriene macrofagen werden proteïne kinase C (PKC) en Ca2+/calmodulin-afhankelijk proteïne kinase II (CaMKII) geïdentificeerd als zijnde minder actief na inhibitie. In de J774 muismacrofaag cellijn vertoonden CaMKII en src familie kinasen (SFK’s) minder activiteit in de geïnhibeerde stalen. Deze resultaten moeten nog verder gevalideerd worden met specifieke methoden.
Aantal pagina's: 241
Jaar van publicatie:2020
Trefwoorden:Doctoral thesis
Toegankelijkheid:Closed