NXT-EYE: integratieve strategie voor genidentificatie in erfelijke blindheid (NXT-EYE-1)

Erfelijke netvliesaandoeningen (IRD) zijn een belangrijke oorzaak van blindheid op jonge leeftijd en hebben een prevalentie van ~1/3,000. Naast een breed spectrum van verschillende klinische subtypes, worden IRD ook gekarakteriseerd door een enorme genetische heterogeniteit. Tot nog toe werden maar liefst 256 genen, opgenomen in RetNet, geassocieerd met IRD, wat het stellen van een moleculair genetische diagnose bemoeilijkt. Recente genetische studies over IRD waarbij doelgerichte next-generation sequencing (NGS), whole exome sequencing (WES) of whole genome sequencing (WGS) gebruikt werden, wijzen op een detectieratio van 50-70%. Dit betekent echter dat nog steeds 30-50% van de IRD patiënten zonder moleculair genetische diagnose blijft. Deze studie heeft niet alleen bijgedragen tot het vergroten van het IRD mutatiespectrum in reeds gekende ziektegenen, maar heeft, nog belangrijker, verschillende types van verborgen genetische variatie in IRD aan het licht gebracht. Zo werden zeldzame nieuwe ziektegenen geïdentificeerd, niet-coderende variaties die de expressie van een kandidaat IRD ziektegen beïnvloeden en kopijveranderingen (CNVs).

De integratie van identity-by-descent mapping, doelgerichte gensequenering en WES in een cohorte van 126 onafhankelijke IRD patiënten van consanguïene origine reveleerde een onderliggend moleculair genetisch defect in een gekend IRD gen in 74% van de patiënten. In totaal werden 92 mutaties in 45 verschillende genen gevonden, waaronder 48 nieuwe mutaties. In een aparte studie toonden we aan dat een nonsense mutatie in FAM161A, c.1309A>T, p.(Arg437*), een founder mutatie is en voorkomt in ongeveer 2% van de autosomaal recessieve retinitis pigmentosa (AR RP) gevallen in de Nederlandse, Belgische en Duitse populaties. Hoewel de aanvangsleeftijd variabel is in deze patiënten, kan de retinale dystrofie erg progressief zijn, waarbij op latere leeftijd een zo goed als volledig verlies van het centraal zicht optreedt.

WES reveleerde mutaties in zes zeldzame nieuwe kandidaatgenen voor IRD: CEP162, EML4, en PATJ in AR RP patiënten, ERICH6 in Senior-Loken syndroom, FBN2 in enhanced S-cone syndroom en DRAM2 in een maculair fenotype. Daarnaast werd met behulp van single nucleotide polymorfisme chip analyse in een patiënt met AR cerebellaire ataxie een grote deletie geïdentificeerd die het GRID2 gen verstoort. Terwijl de meeste van deze genen nog verder functioneel dienen uitgewerkt te worden, werd de rol van GRID2 en DRAM2 in de retina reeds verder onderzocht in het kader van deze thesis. De identificatie van GRID2 als onderliggend ziektegen voor een AR cerebellaire ataxie fenotype geassocieerd met retinale dystrofie zorgde voor de uitbreiding van het klinisch spectrum van GRID2 deletie mutanten.

We toonden GRID2 expressie en lokalisatie aan in humane en muis retina, wijzend op een tot nu ongekende rol van GRID2 in retina. In het kader van een internationale studie werden vier additionele families met een mutatie in het DRAM2 gen geïdentificeerd, waarbij dit gen dat een rol speelt in de initiatie van autofagie, voor de eerste keer geassocieerd werd met IRD. In de muis retina is DRAM2 gelokaliseerd in de fotoreceptor binnensegmenten en aan de apicale zijde van de retinaal pigmentepitheelcellen, wat een rol in de vernieuwing en de recyclage van fotoreceptor buitensegmenten suggereert.

De geïdentificeerde CNVs werden gekarakteriseerd op nucleotideniveau om zo het vermoedelijk onderliggend mechanisme te kunnen identificeren. Zo werden zes complexe CNVs op een hypothese-neutrale wijze gekarakteriseerd gebruikmakende van Targeted Locus Amplification (TLA), een recent beschreven techniek gebaseerd op de crosslinking van fysiek dichtbij elkaar gelegen sequenties, hier voor de eerste keer uitgevoerd op geëxtraheerd genomisch DNA. Daarnaast ontwierpen we ook een op maat gemaakte microarray, genaamd arrEYE, voor CNV analyse met hoge resolutie van gekende en kandidaat IRD genen en in retina tot expressie komende niet-coderende RNAs. Het toepassen van arrEYE op een testcohorte van 57 IRD patiënten reveleerde nieuwe CNVs in USH2A en RCBTB1, en de eerste CNV ooit gerapporteerd in HGSNAT, wat verder zijn recent ontdekte rol in niet-syndromale IRD bevestigt.

 IBD mapping gecombineerd met doelgerichte kandidaatgen screening in een familie met een ongewoon AR RP fenotype reveleerde een gekende homozygote missense mutatie c.448G>A, p.(Glu150Lys) in het RHO gen. Daarnaast werden vier niet-coderende homozygote varianten gevonden in twee SAMD7 genomische regioU+2019s die relevant zijn voor de binding van de retinale transcriptiefactor CRX (CRX-gebonden regioU+2019s, CBRs). Luciferase experimenten en elektroporatie van explantaten van muizenretinaU+2019s met rapporteerconstructen van wild-type en variante SAMD7 CBRs toonde een significante afname van de SAMD7 reporteractiviteit voor de variantconstructen in vergelijking met de wild-type sequenties, wat een cis-regulatorisch effect op de SAMD7 expressie suggereert. Aangezien Samd7 recent geïdentificeerd werd als een Crx-gereguleerde transcriptionele repressor in retina, was het onze hypothese dat deze SAMD7 varianten mogelijks bijdragen aan het retinale fenotype geobserveerd in deze familie. Dit ongewone AR RP fenotype wordt gekarakteriseerd door specifieke pigmentafzettingen die verschillen van de klassieke spiculaire intraretinale pigmentatie geobserveerd in andere individuen homozygoot voor de p.(Glu150Lys) mutatie en in RP patiënten in het algemeen.

Tenslotte werd nog een derde type van verborgen genetische variatie in IRD bestudeerd in het kader van dit project, namelijk CNVs. We brachten het genomische landschap van alle RetNet genen in kaart om zo de genen die vatbaar zijn voor de vorming van CNVs te kunnen identificeren en prioritiseren. Hiertoe werd voor alle RetNet genen een lijst van genomische eigenschappen opgesteld en werd het aantal CNVs in deze genen volgens de Database of Genomic Variants (DGV) en de literatuur in kaart gebracht. Dit reveleerde niet minder dan 1,345 CNVs gerapporteerd in de literatuur. Correlatieanalyse tussen de ranking van de genen volgens de verschillende genomische eigenschappen en het voorkomen van CNVs in deze genen toonde aan dat de sterkste correlatie bestaat tussen de lengte van een gen en het voorkomen van CNVs. Daarnaast identificeerden we eveneens 30 CNVs in 10 RetNet genen (BEST1, EYS, KCNV2, MERTK, OPA1, PCDH15, PDE6G, PRPH2, SPATA7 en USH2A) in IRD patiënten. Dertien van deze CNVs zijn nieuw, waaronder een deletie in het PDE6G gen, waarin tot op heden nog geen CNVs gerapporteerd werden. Drie van deze CNVs, twee in EYS en een in PCDH15, verstoren niet-coderende cis-regulatorische regioU+2019s.