Inheemse Haematococcus pluvialis voor de productie van astaxanthine als toevoegingsmiddel voor diervoeding voor Litopenaeus vannamei

Deze studie beoogt om tot een beter begrip te komen van de genotypische en fenotypische variatie in de astaxanthine producerende groenalg Haematococcus pluvialis. We wilden meer bepaald 1) onderzoeken of H. pluvialis één soort is of uit meerdere soorten bestaat door het analyseren van variatiepatronen in moleculaire merkers, morfologische kenmerken en ecofysiologische voorkeuren, 2) de genetisch gebaseerde component van fenotypische variatie op inter- en intraspecifiek niveau kwantificeren bij Haematococcus met nadruk op kenmerken gerelateerd aan de astaxanthine productiviteit, 3) ons een beeld vormen over de manier waarop responsen van verschillende stammen behorend tot verschillende genotypes kunnen uiteenlopen bij milieuveranderingen, meer bepaald bij variërende lichtintensiteit, 4) de gastheer-specificiteit van Paraphysoderma sedebokerense, een courant pathogeen van H. pluvialis beter begrijpen.

Het eerste deel van dit proefschrift beoogde het genereren van een fylogenetisch kader voor verder vergelijkend onderzoek.

In Hoofdstuk 3 werden genetische, morfologische en ecofysiologische patronen bestudeerd bij Europese Haematococcus stammen geïsoleerd uit 15 locaties verspreid over Europa om de mogelijke soortsniveau variatie te evalueren. Ter vergelijking werd de Europese verzameling aangevuld met geïsoleerde stammen uit Zuid-Amerika en stammen uit cultuurcollecties. De genetische differentiatie van de stammen werd onderzocht op basis van de volledige ITS1 rDNA regio (ITS1-5.8S-ITS2) en voor een selectie stammen ook het rbcL2 chloroplast gen. De aanwezigheid van CBCs3 in ITS1 en ITS2 werd ook geëvalueerd. Fylogenetische analyse resulteerde in zes duidelijke ITS clades - onderbouwd door zowel GMYC4 als statistische parsimonie netwerk analyse5 – waarvan er drie alle Europese stammen bevatten en het grootste deel van de cultuurcollectiestammen. De drie bijkomende clades aanwezig in Haematococcus, worden voorlopig Haematococcus sp. genoemd totdat hun taxonomie verder wordt uitgezocht. De rbcL groep vertoonde veel minder variatie dan de ITS, maar onderscheidde wel twee van de drie ITS groepen waar onze Europese stammen toe behoorden. We hebben drie CBCs gevonden bij elk van de drie Europese clades in de ITS1 secondaire structuur, terwijl er één CBC werd geïdentificeerd bij clades in de ITS2 secondaire structuur. Samen leidde deze resultaten tot het identificeren van drie soorten Haematococcus: een epitype werd voorgesteld voor H. pluvialis en we beschreven twee nieuwe soorten: H. rubicundus en H. rubens.

Ook werd DGGE6 aangewend om deze drie soorten te onderscheiden zonder te moeten sequeneren. De aanwezigheid van bijkomende variatie in Haematococcus laat ons vermoeden dat verdere cryptische soortdiversiteit bestaat. We hebben verder de congruentie met morfologie en temperatuurvoorkeur bepaald voor een selectie stammen die deel uitmaakten van de drie beschreven soorten. Ondanks een grote intraspecifieke variatie en aanzienlijke overlap tussen kenmerken, vonden we significante verschillen in morfologie en groeisnelheid tussen de soorten, hetgeen onze soortafbakening ondersteunde. H. pluvialis en H. rubens hadden gemiddeld meer langwerpige cellen, duidelijkere cytoplasmatische strengen en peervormige protoplasten. De optimale groeitemperaturen waren gelijkaardig voor H. pluvialis, H. rubicundus en H. rubens, nl. variërend tussen 17 en 23 °C, maar H. pluvialis vertoonde gemiddeld een lagere maximale groeisnelheid dan H. rubicundus en H. rubens.

In Hoofdstuk 4 werd de genetisch gebaseerde component van fenotypische variatie gekwantificeerd in een “common garden” experiment, waarbij de zes volgende fenotypische kenmerken van genetisch verschillende stammen werden vergeleken onder strikt identieke omgevingsomstandigheden: groeisnelheid, stationaire fase densiteit, percentage palmelloide cellen, post stress droog gewicht, astaxanthine inhoud en aplanospore biovolume. De verschillen in fenotype die overblijven wanneer alle omgevingsvariatie uitgeschakeld wordt, zijn dan te wijten aan genetische verschillen. Via deze methode hebben we de genetisch gebaseerde intra- en interspecifieke (co-) variatie onderzocht bij zes kenmerken gerelateerd aan astaxanthine productiviteit. Hiervoor werd een totaal van 30 stammen behorend tot H. pluvialis en H. rubicundus onderzocht. Naast 24 eigen stammen werden ook zes H. pluvialis stammen uit cultuurcollecties gebruikt. Dit gebeurde onder (pre-stress) groeivoorwaarden en onder voorwaarden waarbij astaxanthine productie werd opgewekt (post-stress). We vonden een significant reservoir van intraspecifieke variatie in alle zes kenmerken, bepaald door hoge heritabiliteit7, wat de genetisch achtergrond van deze kenmerken bevestigd. Ondanks een significante overlap van soorten voor de onderzochte kenmerken (zowel pre- als post-stress) vonden we soortverschillen in vijf van de zes kenmerken. Tussen de slechtst en de best presterende stammen vonden we zelfs tot een vijftienvoudige factor aan variatie in astaxanthine productiviteit. Het was opvallend dat de stammen van de cultuurcollecties een lagere astaxanthine productiviteit hadden vergeleken met het recent geïsoleerde materiaal behorend tot H. pluvialis, hetgeen waarschijnlijk een verlies van fotoprotectieve capaciteit weerspiegelde gedurende hun langdurige bewaring in cultuur.

De variatie in totale astaxanthine productiviteit in het algemeen hing voornamelijk af van de post-stress kenmerken, eerder dan de pre-stress kenmerken; focus voor verbetering tijdens astaxanthine productie.

In Hoofdstuk 5, bestudeerden we de ecofysiologische reacties van verschillende stammen (behorend tot verschillende genotypes) op lichtintensiteit gedurende de groeifase. De reacties van zes verschillende Haematococcus stammen behorend tot twee soorten (H. pluvialis en H. rubicundus), werden geëvalueerd bij blootstelling aan een lichtgradiënt bestaande uit negen verschillende intensiteiten (2,7,15,30,52,79,114,154 en 222 μmol fotonen m-2 s-1). Er werden systematische vergelijkingen gerealiseerd van batch gekweekte stationaire culturen van de zes stammen voor volgende kenmerken: celtype, celgrootte, mortaliteit, groeisnelheid, celdensiteit, fotosynthetische activiteit evenals kwantitatieve en kwalitatieve pigmentsamenstelling. Significante stam effecten werden gevonden voor alle kenmerken uitgezonderd groeisnelheid en celdensiteit. Verder had lichtintensiteit een significante invloed op alle kenmerken uitgezonderd biovolume. Bovendien vonden we significante lichtintensiteit x stameffecten, of G x E8 (genotype x milieu) invloeden op cel mortaliteit, ratio Fv/Fm9, celdensiteit alsook op pigmentsamenstelling.Dit houdt in dat het niet mogelijk was één uniek optimale lichtintensiteit aan te duiden die resulteerde in verhoogde groei en biomassa-accumulatie die geldig bleek voor alle onderzochte Haematococcus stammen.

In het laatste deel van dit proefschrift wilden we fenotypische variatie gebruiken om resistente stammen te zoeken bij Haematococcus. Hoofdstuk 6, concentreerde op het verband tussen de infectiviteit van het veelvoorkomend pathogeen (in grootschalige kwekerijen van H. pluvialis) P. sedebokerense en het gastheer genus Haematococcus. Kwantitatieve fenotypering werd aangewend om resistente Haematococcus stammen te identificeren. De gastheerspecificiteit van P. sedebokerense (stam PS1) werd namelijk in vitro onderzocht op 44 Haematococcus stammen in een gecontroleerde infectiviteitproef, waarbij de groei en de fotosynthetische activiteit werden gemeten in de aan- en afwezigheid van PS1. Bovendien hebben we op het einde van de test de aanwezigheid van PS1 in de gecontamineerde culturen gekwantificeerd met een hiervoor nieuw ontwikkelde methode, gebruik makend van een fluorescentie metingen na het binden van een P. sedebokerense specifieke kleurstof (WGA10-fluoresceïne). De resulterende metingen werden omgezet in drie infectivitieit-proxies, hetgeen vergelijkin gen onder stammen mogelijk maakte. Significante stam verschillen werden gevonden tussen alle 44 Haematococcus geteste stammen voor de drie onderzochte infectiviteit proxies.

We vonden geen correlatie tussen deze patronen en de fylogenetische achtergrond, noch met de oorsprong van de stam. De helft van de stammen die potentieel een lage gevoeligheid vertoonden voor PS1 hadden dominant geflagelleerde cellen, in tegenstelling tot de overige waar palmelloïde en aplanosporen domineerden. Op een analoge wijze konden we aantonen dat de kwetsbaarheid voor PS1 van een erg gevoelige H. pluvialis stam verminderde in een selectie-experiment op lange termijn door de overheersing van geflagelleerde fenotypes over verschillende generaties van infectie. Onze bevindingen toonden aan dat stamresistentie genetisch bepaald kan zijn, door onder andere verschillen in morfologie.

Samengevat dragen de resultaten van dit onderzoek bij tot het begrip van de genetische, morfologische en fysiologische diversiteit van Haematococcus, zowel op intraspecifiek als interspecifiek niveau. Deze studie draagt bij tot drie van de belangrijkste zuilen voor de ontwikkeling van microalgen (genetische diversiteit, aanpassing aan het milieu, fenotypische karakterisering) en viseert een bredere toegepaste context, waarbij de uiteindelijke bedoeling is hoogwaardige stammen te verkrijgen met een breed aanpassingsvermogen en een hoge weerstand tegen pathogenen.