De ontwikkeling van een nieuw intracellulaire Ca2+-buffer en de invloed ervan op de celfunctie

Intracellulaire Ca2+ signalen spelen een centrale rol in verschillende fysiologische processen. Daarom is adequate regulatie van Ca2+ signalering cruciaal voor het goed functioneren van celsystemen, terwijl ontregeling ervan betrokken is bij verschillende ziekten, waaronder kanker en neurodegeneratieve ziekten. Bovendien hebben inzichten in de moleculaire mechanismen die aan de grondslag liggen van Ca2+ signalering en de bijdrage ervan aan ziekte de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën en instrumenten gestimuleerd. In de context van fundamenteel onderzoek gericht op de rol van intracellulair Ca2+ in verschillende ziekten, worden chemische, cel-permeabele Ca2+ buffers, waaronder BAPTA-AM, vaak gebruikt om het belang van intracellulaire Ca2+ signalering in een bepaald biologisch proces te ontrafelen. Recente studies tonen echter aan dat de wereldwijd gebruikte intracellulaire Ca2+ buffer BAPTA-AM ook andere cellulaire componenten als doelwit heeft, zoals het Na+/K+-ATPase en PFKFB3. Dit betekent dat de universeel gebruikte Ca2+ buffer BAPTA-AM niet langer als een betrouwbare tool kan worden beschouwd, omdat het tal van andere signaalroutes kan beïnvloeden. Deze bevindingen zetten aan tot de ontwikkeling van nieuwe Ca2+ chelatoren voor het bestuderen van intracellulaire Ca2+ signalering in fundamenteel onderzoek. Bovendien zal het onderzoeken van alle directe bindingspartners van intracellulair BAPTA nuttig zijn om het mechanisme achter BAPTA-geïnduceerde celdood te ontrafelen. Het doel van dit project is viervoudig: 1. Ontwikkeling van BAPTA varianten met verminderde PFKFBP3 inhibitie met als doel een variant te creëren die efficiënt Ca2+ kan cheleren maar niet de off-target effecten vertoont die waargenomen werden met BAPTA. 2. Ontwikkelen en testen van foto-activeerbare BAPTA probes op PFKFB3 en het cellulaire proteoom via een photo-affinity labeling (PAL) experiment om directe bindingspartners van BAPTA te identificeren. 3. Exploiteren van gekende BAPTA varianten (Fura-2, Fluo-3, Fluo-4, Fluo-8, Indo-1, Cal 590/520) met snelle Ca2+-bindingskinetiek en hun impact op PFKFB3 en downstream signalisatie (mTORC1/MCL-1). 4. Onderzoek naar de impact van BAPTA op metabolisme en autofagie.