Anti-ADAMTS13 auto-antilichaamprofielen in de pathofysiologie van trombotische trombocytopenische purpura

Immuungemedieerde trombotische trombocytopenische purpura (iTTP) wordt veroorzaakt door een ernstig tekort aan ADAMTS13 als gevolg van de aanwezigheid van auto-antilichamen tegen ADAMTS13. Het ontbreken van een functioneel enzym leidt tot de vorming van plaatjesrijke microthrombi, aangezien de splitsing van zeer grote von Willebrand-factor (VWF) multimeren in kleinere multimeren wordt belemmerd. De vorming van microtrombi leidt tot orgaanfalen, ernstige trombocytopenie en hemolytische anemie. Zonder snelle behandeling is deze aandoening dodelijk en zelfs met tijdige behandeling blijft het sterftecijfer nog steeds oplopen tot 20%.

Om het ziekteproces van iTTP beter te begrijpen, onderzochten we de bindingsplaatsen van anti-ADAMTS13-autoantilichamen op ADAMTS13 en ontwikkelden daarom een ‘epitoop-mapping’ test (Doelstelling 1). Deze assay maakte het gemakkelijker om de epitopen van anti-ADAMTS13-auto-antilichamen accurater te bepalen aangezien er kleine niet-overlappende fragmenten van ADAMTS13 (M, DT, CS, T2-T5, T6-T8, CUB1-2) gebruikt werden, in tegenstelling tot de relatief grote, overlappende ADAMTS13-fragmenten die gebruikt werden in eerdere studies. Verder liet deze ‘epitoop-mapping’ ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), die gemakkelijk uit te voeren is en slechts kleine hoeveelheiden patiëntenplasma of -serum vereist, toe om grote cohortes van iTTP-patiënten te screenen.

Meer nog, om de opvolging en behandeling van iTTP-patiënten te verbeteren, is er een stijgende interesse in biomerkers die het ziekteverloop en plots herval kunnen voorspellen. Daarvoor zou, zoals bij andere auto-immuunaandoeningen, het immuunprofiel een interessante biomerker kunnen zijn. Daarom bepaalden we de epitopen van de anti-ADAMTS13-autoantilichamen in zowel remissie (n=50) als acute fase (n=131) stalen van een grote cohorte iTTP-patiënten, afkomstig uit verschillende centra, wat toeliet om de meest voorkomende immuunprofielen te bepalen.

Verrassend genoeg, had in onze iTTP-patiëntengroep slechts 74.8% van de stalen detecteerbare anti-CS-autoantilichamen hoewel er bij eerdere epitoopmapping studies bij bijna 98% van de patiënten anti-CS-autoantilichamen werd gevonden. Het meest voorkomende immuunprofiel was hetzelfde in beide fasen namelijk een immuunprofiel met enkel anti-CS auto-antilichamen (Profiel 1). Vervolgens onderzochten we of bepaalde immuunprofielen gelinkt konden worden met klinische data (Doelstelling 2).

Hoewel we geen sterk verband tussen immuunprofielen en ernst van de ziekte konden aantonen, werd een correlatie tussen het meest voorkomende immuunprofiel (Profiel 1) en leeftijd én tussen de aanwezigheid van anti-T2-T5 auto-antilichamen en leeftijd wel waargenomen. Verder stelden we ook een correlatie vast tussen de afwezigheid van anti-CUB1-2 autoantilichamen en cerebrale problemen gelinkt aan TTP. Het aantal iTTP-patiëntenstalen waarvan klinische data beschikbaar was, was echter vrij beperkt. Daarom is een vervolgstudie met een groter aantal iTTP-patiëntenstalen vereist om een potentieel verband tussen ernst van de ziekte en immuunprofiel te achterhalen.

Grote volumes recombinant ADAMTS13 (rADAMTS13) zijn nodig in fundamenteel onderzoek om het werkingsmechanisme van ADAMTS13 te bestuderen en om het ziekteproces van iTTP te onderzoeken. Recombinant ADAMTS13 wordt echter normaal tot expressie gebracht in relatief lage concentraties. Daarom streefden we ernaar om de productie van het rADAMTS13 eiwit te verbeteren door ofwel een beter signaalpeptide te gebruiken of een N-terminaal fusie-eiwit in combinatie met de QMCF technologie te gebruiken (Doelstelling 3).

Ook al was de expressie van rADAMTS13 reeds drie keer hoger door het gebruik van het factor VII-signaalpeptide in vergelijking met het standaard signaalpeptide, verhoogde de ontwikkeling van een N-terminaal fusie-eiwit van ADAMTS13 met het albuminedomein 1 (AD1-ADAMTS13) de expressie nog 15 keer. Sterker, dat het AD1-ADAMTS13-eiwit zijn activiteit om VWF te knippen behield, ondersteunt het gebruik van dit fusie-eiwit in fundamenteel onderzoek.

In deze PhD thesis ontwikkelden en valideerden we een epitoopmapping ELISA en ontcijferden we de immuunprofielen van iTTP patiënten tijdens remissie en acute fase in een grote cohorte iTTP-patiëntenstalen, afkomstig van verschillende centra. Daarnaast kon de expressie van rADAMTS13 sterk verhoogd worden door een AD1-ADAMTS13-fusie-eiwit te genereren.