BMP-technologie een Cel Gebaseerde Implants: Een Dream Team voor Bot Regeneratie.

Botbreuken zijn de meest voorkomende traumatische blessures die op de dag van vandaag in grote organen voorkomen. Botheling is een complex en nauw gereguleerd proces dat een minimaal aantal progenitorcellen vereist voor de aanmaak van nieuw botweefsel. De functie van deze cellen wordt gestuurd door een samenspel van biochemische, fysische en mechanische factoren en voornamelijk gebaseerd op fenomenen tijdens embryonale skeletontwikkeling. In de meerderheid van de botbreuken ontstaat er uiteindelijk een volledig hersteld orgaan met de vorm, grootte en sterkte van het oorspronkelijk bot. Kritische botbreuken (> 3cm) waarbij het omgeven weefsel zwaar beschadigd is, resulteert echter vaak in een nonunion. Omdat er geen betrouwbare behandelingen voor deze botbreuken beschikbaar zijn, is men vaak genoodzaakt tot een pijnlijke procedure zoals osteodistractie en beenamputatie. Er is dus bijgevolg een grote medische noodzaak voor een alternatieve strategie om deze grote, complexe botbreuken te helen. Daarbij is het essentieel om een biomimetische benadering die steunt op principes uit de ontwikkelingsbiologie te hanteren. Geleidelijk aan groeien de mogelijkheden voor zulke biomimetische alternatieven, al blijft de nood voor een effectieve en betrouwbare oplossing gebaseerd op een fundamentele kennis van de onderliggende processen, onbeantwoord.  

Gebaseerd op een ‘developmental engineering’ benadering, gebruikte het onderzoek gepresenteerd in deze verhandeling gezonde botheling als een afdruk om de ingenieursprincipes na te bootsen die nodig zijn om een celgebaseerd construct te ontwikkelen voor de heling van een kritische botbreuk. Omdat de cellen de drijvende kracht zijn in weefselvorming, werden humane periostale cellen (hPDCs), het belangrijkste celtype tijdens botheling, gebruikt als de basis van het construct. Er werd daarenboven vooropgesteld dat een effectieve en alternatieve behandeling best ontwikkeld kan worden door een experimentele, computationele en ‘reverse engineering’ benadering te combineren.

Om een stimulerende factor te bepalen die op een biomimetische manier osteochondrogene differentiatie van hPDCs induceert, werden de vroeg-moleculaire gebeurtenissen voorafgaand aan hPDC-gemedieerde botvorming nader bestudeerd. Een model gebaseerd op calcium fosfaat (CaP)-geïnduceerde botvorming gaf inzicht om verder kennis te ontwikkelen rond de vroeg-moleculaire gebeurtenissen die botvorming door hPDCs bepalen. Er werd aangetoond, via een computationele benadering, dat voldoende Ca2+ uitscheiding van de biomaterialen leidt tot een robuste activering van de  Bone morphogenetic protein (BMP)-, Wingless-related integration site (Wnt)- en Protein Kinase C (PKC)-signaleringspathways. Anderzijds leidt een overmaat aan Ca2+ uitscheiding tot PKC-gemedieerde inhibitie van de Wnt-signalling pathway.

Omdat de botvormende capaciteit traag en beperkt was in het voorgaand model van CaP-geïnduceerde hPDC-gemedieerde botvorming, werd vooropgesteld dat een klinisch relevantere uitkomst bereikt kon worden door een ‘reverse engineering’ benadering. Robust geactiveerde BMP-signalering bleek cruciaal te zijn voor de botvormingscapaciteit van hPDCs en daarvoor werden de liganden die betrokken zijn in botbreukherstel onderzocht op hun mogelijkheid om osteochondrogene differentiatie van hPDCs te onderzoeken in vitro.De meest potente liganden werden vervolgens gecoat op CaP-draagstructuren voorafgaand aan de zaaistap waarin cellen gezaaid werden op de draagstructuren. Afhankelijk van het type BMP-ligand alsook de biomateriaalkarakteristieken, werd een specifieke  in vitro activering van intracellulaire signalering geobserveerd. In vivo resulteerden deze in construct-specifieke skeletale weefselvorming waarin het  synergistische stimulatieve effect leidt tot bot ‘ossicle’ vorming.

Deze bevindingen bevestigden dat  BMP-liganden geschikte stimulerende factoren zijn in een hPDC-gebaseerd construct voor de heling van een kritisch botdefect. Deze constructen vereisen echter een actieve levering van recombinante groeifactoren wat een beperking vormt  in termen van regulering. Om dit obstakel te overwinnen, werd vooropgesteld dat de huidige beperkingen in  in vitro priming protocollen te wijten kunnen zijn aan het gebruik van serum. De niet gecontroleerde aanwezigheid van cytokines, eiwitten en inhibitoren in serum zou immers kunnen interfereren met stimulerende factoren zoals BMPs. Als gevolg, werd een serumvrij, chemisch gedefinieerd medium (CDM) dat in staat is om celviabiliteit te onderhouden zonder proliferatie te induceren, samengesteld. In vitro stimulatie van monolaagkweken van hPDCs in BMP-2-verrijkt CDM leidde tot een verbeterde osteo-chondrogene response in vitro. Wanneer gezaaid op een CaP-scaffold, werd een verhoogde botvormingcapaciteit waargenomen  in vivo. Omdat standaard in vitro kweken van hPDCs gebeuren in de aanwezigheid van serum, werd verondersteld dat een verbeterde capaciteit nog verder verbeterd zou kunnen worden door een serumvrije pre-conditioneringsperiode toe te voegen voorafgaand de BMP-stimulatie. Tijdens de pre-conditionering in CDM, vertoonden hPDCs een veranderd fenotype zoals een veranderde celcyclus en een verhoogde expressie van  CD34 en BMP type 1 en type 2 receptoren. Tijdens in vitro BMP-stimulatie, toonden deze cellen een meer uitgesproken osteochondrogeen differentiatieprofiel en een verhoogde productie van kraakbeenmatrix  in vivo.

Tenslotte werden CDM pre-geconditioneerde cellen in aggregaten geassembleerd zodanig dat dit de initiële cellulaire condensaties voorafgaand celdifferentiatie nabootste. Dit heeft geleid tot celspecificatie wat, na BMP-stimulatie en ectopische in vivo implantatie, resulteerde in weefselontwikkeling gelijkend op vroeg endochondrale botvorming. Analyses van het construct in een kritische botbreuk toonden een overbrugging van het defect binnen de vier weken na transplantatie.

Samengevat tonen de resultaten gepresenteerd in deze verhandeling dat een robust, voorspelbare en biomimetisch cel-gebaseerd construct ontwikkeld kan worden via een biomimetische benadering. De voorgestelde resultaten tonen het belang van het definiëren van het specifieke alsook gecombineerde stimulerend effect van alle factoren betrokken in het uiteindelijke construct voor de klinische uitkomst.