De inductie van geprogrammeerde celdood door synergistische modulatie van glycolytische flux en Ras activatie in gist en kanker cellen

De katabole afbraak van glucose door glycolyse is één van de oudste en meest geconserveerde manieren om bio-energetische homeostase te voeden en te onderhouden. Zowel gist- als kankercellen fermenteren glucose naar ethanol of lactaat, respectievelijk, ter ondersteuning van ongeremde celgroei. Kankergroei houdt een enorm risico in voor de gezondheid van de mens, gezien miljoenen mensen nog steeds sterven aan de consequenties ervan. Snel delende kankercellen vertrouwen vaak op een sterke glucoseopname voor het onderhouden van hun aerobische glycolyse, ook wel het Warburgeffect genoemd, wat positief gecorreleerd is met hun agressiviteit, metastatisch potentieel en verhoogde resistentie tegen chemotherapeutica en bestraling. Hierdoor is er nog steeds nood aan het vinden van nieuwe therapeutische doelwitten of middelen om de aandoening te bestrijden. Gezien het feit dat glycolytische kankers vaak berusten op een verhoogde opname van glucose, zou het inhiberen van de glucoseopname het potentieel bezitten om deze cellen selectief te doden of hun algemene fitness te verminderen, waardoor deze terug gevoelig kunnen worden aan reeds bestaande therapieën.

In dit doctoraatsonderzoek hebben we gewerkt met een specifieke Saccharomyces cerevisiae stam die een overactieve flux doorheen de glycolyse vertoont wanneer deze op glucose opgegroeid wordt. We hebben deze mutant gebruikt als een translationeel model voor het Warburgeffect. Als zodanig kan de tps1∆ stam niet langer de hexokinasen inhiberen doordat deze geen trehalose-6-fosfaat meer kan aanmaken. Bijgevolg leidt dit tot een extreme opstapeling van suikerfosfaten, Ras overactivatie en uiteindelijk apoptose wanneer deze mutant opgegroeid wordt op glucose. Door een compound library te screenen gebruikmakend van de tps1∆ stam op een groei-inhiberende glucoseconcentratie, hebben we één compound geïsoleerd, zijnde Warbicin-A (WBC-A), die de groei kon herstellen. Mode-of-action studies toonden aan dat WBC-A werkt als een glucosetransportinhibitor waardoor deze de glycolytische deregulatie normaliseert in de tps1∆ stam. Om de structuur-activiteitsrelatie te bepalen en nieuwe compounds te isoleren met verbeterde eigenschappen, hebben we een compound collectie samengesteld van structurele analogen die we gescreend hebben gebruikmakend van de tps1∆ stam. Dit leidde tot de identificatie van WBC-2C die glucoseopname tot 6 keer sterker inhibeerde vergeleken met WBC-A in S. cerevisiae.

WBC-A activiteit bleek geconserveerd in humane cellijnen gezien zowel groei alsook glucoseopname door A549 longadenocarcinomacellen dosisafhankelijk werd geïnhibeerd. Dezelfde analoge compound collectie werd gescreend voor groei-inhibitie van deze A549 cellen wat leidde tot de isolatie van drie analogen die glucosetransport sterker inhibeerden: WBC-15C, -4C en -11C. Naast de 549 cellijn inhibeerden Warbicin compounds ook de groei van MCF10A borstepitheelcellen en die van U266 en KMS-12-PE mulitple myelomacellijnen, wat de breedspectrumactiviteit van deze compoundklasse bevestigde. Bij de evaluatie van deze compounds voor hun modes-of-action ter opname van 2-deoxylglucose (2DG) door A549 cellen werden verschillende mechanismen waargenomen: WBC-A en WBC-4C inhibeerden 2DG opname niet-competitief, terwijl WBC-15 competitief inhibeerde en WBC-11C oncompetitief. Muisexperimenten zullen uitwijzen ofdat WBC compounds ook in vivo activiteit vertonen.

WBC compounds werden gebruikt om het inhibitiemechanisme van glucosetransport in detail te bestuderen. Zo vonden we dat WBC-A alle glucosetransporters in S. cerevisiae kan inhiberen en dat de inhibitie sterk afhankelijk is van de aanwezigheid van functionele hexokinasen. WBC-A inhibeerde de carrier minder sterk wanneer de hexokinasen gedeleteerd werden. We toonden ook aan dat WBC-A de transportsnelheid vermindert, niet alleen door de transporter te inhiberen, maar ook door de capaciteit van hexokinase om inkomend glucose meteen te fosforyleren te verminderen. Gezien de structurele gelijkenissen tussen WBC compounds en ATP, stellen we voor dat de nieuwe familie van synthetische inhibitoren de binding van ATP aan de transporter nabootst. In het licht van de transportgeassocieerde fosforylatie (TAP) hypothese verminderen WBC compounds mogelijks hexokinaseactiviteit op een spatio-temporale manier door ATP van de transporter te verdringen. We stellen voorop dat TAP-gerelateerde processen mogelijks de glycolytische flux in kankercellen kan ondersteunen en dat normale cellen hier niet hevig op zouden berusten. Op deze manier kunnen WBC compounds zich onderscheiden van reeds bestaande glucosetransportinhibitoren door zowel transport alsook fosforylatie van hexosesuikers te targetten.

Dit werk beschrijft de identificatie, karakterisatie en evaluatie van een nieuwe klasse van glucosetransportinhibitoren. De geconserveerde actie maakt van WBC compounds een nieuwe moleculaire tool voor het beter begrijpen en bestuderen van hexosetransport in gist en mens. WBC compounds zijn veelbelovend voor het therapeutisch behandelen van glycolytische kankergroei, alleen of in combinatie met reeds bestaande therapieën.