< Terug naar vorige pagina

Project

De relatie tussen samenstelling en functionaliteit van de microbiële gemeenschap in laboschaal anaerobe vergistingsreactoren bestudeerd aan de hand van biologische replica’s

Anaerobe vergisting (AV) is de afbraak van organisch materiaal door een microbiële gemeenschap in afwezigheid van zuurstof met de vorming van biogas, biomassa en een nutriëntrijk restproduct. De mogelijkheid om naast afvalverwerking ook energie te produceren zorgt voor een groeiende interesse in het toepassen van AV als afvalverwerkingstechnologie. Daarbij heeft anaerobe vergisting voor de verwerking van vloeibare stromen enkele bijkomende voordelen ten opzichte van de conventionele aerobe verwerking. Onder meer het lager energieverbruik, de kleinere benodigde oppervlakte en een kleiner volume aan restproduct zijn belangrijke voordelen. Echter, er zijn ook een aantal nadelen van een anaerobe t.o.v. een aerobe technologie. Dit zijn onder meer het risico op uitspoeling van de traag groeiende anaerobe biomassa, de vaak tragere opstart van anaerobe systemen en de hogere gevoeligheid van de anaerobe microbiële gemeenschap voor veranderingen in omgevingscondities. Het eerste nadeel is voor een groot deel opgelost met de ontwikkeling van reactoren waarin de anaerobe biomassa wordt geconcentreerd. Verder is er met de groeiende toepassing van anaerobe vergisting een grotere beschikbaarheid aan actief anaeroob slib om nieuwe reactors snel op te starten, waarmee ook het tweede nadeel grotendeels verdwenen is. De gevoeligheid van de anaerobe microbiële gemeenschap daarentegen is nog steeds een belangrijke reden waarom een aeroob boven een anaeroob systeem wordt verkozen. Hoewel een betere kennis van het anaerobe proces het stabiel opereren van anaerobe reactoren al sterk heeft verbeterd, blijft het risico op variabele prestaties en reactorfalen de toepassing van anaerobe afvalverwerking beperken.
De werking van een anaerobe reactor is rechtstreeks gerelateerd met de microbiële gemeenschap in de reactor. Een beter inzicht in die gemeenschap, waarbij microbiële indicatoren voor performantie en stabiliteit aangeduid worden, is daarom van belang om de opvolging en operatie van anaerobe reactoren te optimaliseren. Ondanks vele pogingen om microbiële parameters aan te duiden die gecorreleerd zijn met de werking en stabiliteit van het anaerobe vergistingsproces, is het gebruik van dergelijke parameters voor het opvolgen en opereren van anaerobe reactoren nog lang niet gangbaar. De voornaamste factoren die deze vooruitgang beperken zijn de grote microbiële diversiteit met een hoge functionele redundantie en complexe microbiële interacties binnen de
gemeenschap. Een beter inzicht in de verhouding tussen de samenstelling en de functionaliteit van de gemeenschap wordt beperkt door het gebrek aan reactorstudies bij sterk gecontroleerde operationele en omgevingscondities, waarbij biologische herhalingen worden gebruikt. Door de hoge functionele redundantie binnen de anaerobe microbiële gemeenschap is de variatie in de samenstelling ervan en het effect op de performantie van de reactor moeilijk samen te vatten.

De algemene doelstelling van deze studie omvat (i) een beter inzicht te verkrijgen in de factoren die de samenstelling van de microbiële gemeenschap – zowel fylogenetisch als functioneel – in anaerobe reactoren beïnvloeden, (ii) de relatie tussen de microbiële gemeenschap en de performantie van de reactor te bekijken en (iii) gemeenschappelijke species en functies aan te duiden in AV reactoren. Daarbij legden we de focus op de rol van het inoculum en van factoren die de microbiële gemeenschap onder druk zetten, zoals een verandering in de influentsamenstelling. In tegenstelling tot veel andere studies van anaerobe reactorgemeenschappen, werden biologische herhalingen gebruikt om inzicht te verwerven in de biologische variatie van de anaerobe microbiële gemeenschap en de invloed van stochastische en deterministische factoren te bepalen. De fylogenetische structuur van de microbiële gemeenschap werd bestudeerd aan de hand van het sequeneren van PCR amplicons van zowel het 16S rRNA gen als 16S rRNA transcripts om respectievelijk de totale en de actieve gemeenschap te bekijken. Een functionele analyse van de microbiële gemeenschap werd uitgevoerd met behulp van proteïne tandem massaspectrometrie.

In een eerste hoofdstuk bestudeerden we de invloed van de microbiële samenstelling van het inoculum op de samenstelling van de reactorgemeenschap en performantie van de reactoren. We onderzochten of dezelfde microbiële gemeenschappen ontwikkelden onder identieke operationele condities, na het stapsgewijs verhogen van de organische belading en uitgaande van drie verschillende inocula. Om het deterministisch en stochastisch karakter van het proces te bekijken werden vier biologische herhalingen per inoculum opgestart. Alle reactoren vertoonden een gelijkaardige methaanproductie en vetzuurprofiel. Uit de analyse van de microbiële gemeenschap bleek in biologische herhalingen een reproduceerbare totale en actieve gemeenschap te ontwikkelen, hetgeen
aantoont dat voornamelijk deterministische factoren de samenstelling van de anaerobe reactorgemeenschap sturen. Daarnaast bleek een significant verschil in de microbiële gemeenschap van verschillend geïnoculeerde anaerobe reactoren, hetgeen de aanwezigheid van functioneel redundante organismen in de anaerobe reactoren aantoont. In alle reactoren waren de dominante species vooral species die niet, of met zeer lage abundantie, gedetecteerd werden in het inoculum. Dit wijst op het belang van een hoge diversiteit in de inocula die worden gebruikt voor het opstarten van anaerobe reactoren. Een geleidelijke opstart, met initieel een lage organische belading, heeft er vermoedelijk toe geleid dat zeldzame organismen in het inoculum zich kunnen vestigen in een nieuwe succesvolle coöperatieve AV-gemeenschap.

In een tweede hoofdstuk onderzochten we hoe de samenstelling van de microbiële gemeenschap wordt beïnvloed door een stressfactor onder de vorm van de aanwezigheid van fenol in het influent. Fenol is een moeilijk afbreekbare organische component aangezien het toxisch is voor het anaerobe vergistingsproces. Hiervoor werden laboschaal anaerobe reactoren opgestart met vier verschillende inocula en drie biologische herhalingen per inoculum en gevoed met eenvoudig afbreekbaar organische moleculen in combinatie met een stijgende concentratie fenol. Drie inocula waren afkomstig van anaerobe reactoren waarvan het influent fenol of afgeleide moleculen bevatte, terwijl het vierde inoculum afkomstig was van een reactor waarvan het influent dergelijke
moleculen niet bevatte. Op die manier trachtten we na te gaan hoe een voorafgaande blootstelling aan fenolische moleculen de AV van een fenolrijk influent beïnvloedt. Een vergelijking van de microbiële gemeenschappen van de verschillende reactoren liet toe om micro-organismen te identificeren gerelateerd met fenolafbraak. Het inoculum dat niet vooraf was blootgesteld aan fenol of fenol-afgeleiden ontwikkelde in alle drie de biologische herhalingen een reactorgemeenschap die succesvol bleek in AV van het fenolrijk influent. Dit in tegenstelling tot de vooraf blootgestelde inocula, waarvan slechts één inoculum succesvolle AV ontwikkelde en dit slechts in twee van de drie biologische herhalingen. In reactoren met hoge methaanproductie, werd ook steeds fenolafbraak gemeten. Fenolverwijdering lijkt dus essentieel voor de anaerobe reactor om een continue fenolaanvoer te kunnen tolereren. Voor de reactoren met een stabiele hoge performantie bleken biologische herhalingen opnieuw reproduceerbare microbiële gemeenschappen te ontwikkelen. De introductie van fenol leek de deterministisch gestuurde samenstelling van de microbiële gemeenschap niet te beïnvloeden. In onstabiele reactoren daarentegen was de microbiële gemeenschap niet reproduceerbaar per inoculum. De hoge performantie in stabiele reactoren was gerelateerd met een dominante aanwezigheid van Lactivibrio, Mesotoga, Syntrophus en Cryptanaerobacter, waarvan de laatste twee in verschillende studies reeds gerelateerd werden met anaerobe fenolbraak. Deze organismen waren aanwezig in lage abundantie zowel in de inocula van stabiele als van onstabiele reactoren. Deze studie toont aan dat het gebruik van vooraf blootgestelde inocula niet noodzakelijk de tolerantie van de reactorgemeenschap voor fenol, noch de performantie van de reactorgemeenschap bevordert. Daarenboven blijkt dat het opstarten van een anaerobe vergisting met een fenolrijke afvalstroom niet steeds voorspelbaar is, alsook dat in de aanwezigheid van fenol de samenstelling van de microbiële gemeenschap in stabiele reactoren nog steeds deterministisch gestuurd wordt. Een vergelijking van de totale en de actieve reactorgemeenschap toonde een sterkere respons op wijzigingen in de omgevingscondities en op een reactorfalen in de actieve dan in de totale microbiële gemeenschap, hetgeen suggereert dat een shift in de reactorgemeenschap eerder in de actieve dan in de totale microbiële gemeenschap gedetecteerd kan worden.

Omwille van de functionele redundantie die we observeerden in de laboschaal anaerobe reactoren in voorgaande hoofdstukken, werd in een derde hoofdstuk onderzocht of de reactoren meer gelijkende functionele profielen (enzymatische activiteit) bezaten dan de sterk verschillende fylogenetische profielen. Daarvoor werd een metaproteoomanalyse uitgevoerd van reactoren met eenzelfde functionaliteit bij dezelfde operationele condities. Een significant grotere gelijkenis tussen de functionele dan tussen de phylogenetische profielen van zowel de totale als de actieve gemeenschap werd vastgesteld. Dit bevestigt het idee dat door de hoge functionele redundantie in een anaerobe reactorgemeenschap, robuuste microbiële indicators van stabiele performantie eerder op functioneel dan op fylogenetisch niveau gevonden kunnen worden. In de bestudeerde reactoren werden gemeenschappelijke en zeer abundante enzymen gedetecteerd die verantwoordelijk zijn voor reacties die plaatsvinden tijdens het anaerobe vergistingsproces.

Het laatste hoofdstuk beschrijft de kwalitatieve metaproteoomanalyse van de fenol-gevoede reactoren met als doel functionele indicatoren aan te duiden die gerelateerd zijn met stabiele anaerobe afbraak van fenolrijk influent. Daarbij werd het effect van fenol op het metaproteoom van de anaerobe gemeenschap bestudeerd door de metaproteomen van reactoren met en zonder fenolvoeding te vergelijken. Slechts één eiwit dat gemeenschappelijk en abundant was in stabiele reactoren zonder fenolvoeding werd niet gedetecteerd in de fenol-gevoede reactoren. Daarnaast werd in stabiele fenol-gevoede reactoren een eiwit gedetecteerd dat betrokken is bij de acetotrofe methanogenese, hetgeen in sommige reactoren afwezig was na een periode van onstabiele performantie met hoge fenolconcentraties. Dit is mogelijk het gevolg van een shift van een acetotrofe naar een hydrogenotrofe methanogenese na fenolintoxicatie. De metaproteoomanalyse van fenol-gevoede reactoren leverde verder het bewijs dat fenol via benzoyl-CoA en verder tot acetyl-CoA werd afgebroken.

Samengevat toont dit onderzoek de variabiliteit van de anaerobe microbiële gemeenschap op functioneel maar vooral op fylogenetisch niveau, door gebruik te maken van laboschaal anaerobe reactoren met biologische herhalingen en een combinatie van amplicon-sequenering en metaproteoomanalyse. Deze resultaten kunnen helpen om de microbiële ‘black box’ in anaerobe reactoren beter te begrijpen en de opties voor microbiële indicatoren voor het opereren en opvolgen van AV reactoren te evalueren.

Datum:19 feb 2014 →  13 feb 2020
Trefwoorden:Anaerobic digestion, Community ecology, 16S rRNA amplicon sequencing, Metaproteomics
Disciplines:Bodemwetenschappen, uitdagingen en vervuiling, Landbouw, land- en landbouwbedrijfsbeheer
Project type:PhD project