Een innovatief antigeen-specifiek platform, gebaseerd op L. lactis, voor de behandeling van type 1 diabetes: noodzakelijke stappen op de weg naar een succesvol klinische toepasbaarheid.

Bij type 1 diabetes (T1D) wordt de insuline-producerende bètacel vernietigd door het afwijkend immuunsysteem, wat leidt tot dysregulatie van de bloedglucose met hyperglycemie tot gevolg. Tot op heden zijn patiënten afhankelijk van externe insuline om te overleven, maar beperkingen zoals onwetende hypoglycemie en suboptimale glycemische controle die leiden tot micro- en macrovasculaire complicaties zijn nog steeds aanwezig. Hoewel een combinatie van de aanwezigheid van autoantilichamen tegen eilandjes van Langerhans in het serum, genetische factoren, en metabolische eigenschappen met hoge nauwkeurigheid kan voorspellen zij die de ziekte zullen krijgen, kan de huidige farmacologische therapie de ziektevoortgang niet verhinderen of vertragen. Bovendien hebben interventies bij patiënten met pas gediagnosticeerde T1D met klinisch aanvaardbare dosissen van één enkel systemisch immunomodulerend geneesmiddel, zoals aCD3, of antigeen-specifieke behandelingen, zoals orale insuline, niet aan de verwachtingen voldaan. Verder is hun werkzaamheid niet uniform bij alle T1D patiënten, wat enerzijds de complexiteit van deze multifactoriële ziekte en anderzijds de heterogeniteit van deze patiëntenpopulatie benadrukt. De orale autoAg-afgifte als middel om mucosale tolerantie te induceren wordt gehinderd door praktische uitdagingen in verband met eiwitdegradatie in het maagdarmkanaal. Recombinant-biologisch ingeperkte levende L. lactis-bacteriën hebben bewezen veilig te zijn en goed verdragen te worden in preklinische diermodellen en in verschillende klinische studies, wat deze bacteriën ideaal maakt voor de synthese en de aflevering van autoAg in het maagdarmkanaal. GM L. lactis die pro-insuline (PINS) samen met het biologisch actieve immunoregulerende cytokine IL-10 (LL-PINS+IL-10) afscheidt kon met succes glucosehomeostase hersteld worden recent gediagnostiseerde NOD-muizen wanneer het gecombineerd werd met een lage dosis aCD3. Dit steunt het idee dat nu verscheidene jaren in het domein van T1D is gegroeid gebaseerd op preklinische onderzoek, wat stelt dat combinaties van algemene immune modulatie en Ag-specifieke benaderingen de beste strategie zijn om T1D stabiel te genezen of te verhinderen. De klinische vertaling is in het verleden echter mislukt door een gebrek aan biomerkers, foute dosering, ongeschikte eindpunten, timing van interventie en een gebrek aan inzicht in het werkingsmechanisme. Hier wilden we deze potentiële valkuilen verder onderzoeken voor de combinatie therapie (CT) van een lage dosis aCD3 in combinatie met LL-PINS+IL-10.

Eerst genereerden we een klinisch inzetbare recombinante L. lactis stam die geschikt is voor menselijke toepassing en menselijke pro-insuline en IL-10 kan afscheiden. In combinatie met een lage dosis aCD3 was deze CT in staat om diabetes te genezen in 66% van de nieuw gediagnosticeerde diabetische NOD muizen, wat vergelijkbaar met plasmide-gedreven L. lactis. De aanvankelijke bloedglucoseconcentraties (<350 mg/dL) en de insuline autoantilichaam (IAA)-positiviteit waren voorspellers van een stabiele omkering van de hyperglycemie en een vermindering van de IAA-positiviteit was een immuunbiomerker van de therapeutische uitkomst. Beoordeling van de immuunveranderingen geïnduceerd door de L. lactis-gebaseerde CT toonde verhoogde frequenties van CD4+Foxp3+ T-cellen in de pancreas drainerende lymfeklieren, pancreas en perifeer bloed van alle behandelde muizen, onafhankelijk van de metabole uitkomst. Echter, CD4+Foxp3+ T-cellen van CT-genezen muizen hadden een hogere CTLA-4 expressie, aanduidend op een betere functionaliteit in vivo.  Neutralisatie van CTLA-4 en TGF-β heeft de suppressieve functie van de door therapie geïnduceerde Tregs gedeeltelijk opgeheven. Ablatie of functionele beperking van Foxp3+ Tregs in vivo pre- of post-therapie verhinderde immuuntolerantie, waarbij wordt benadrukt dat de CT-geïnduceerde tolerantie bij muizen met nieuw gediagnosticeerde diabetes afhankelijk is van de aanwezigheid en functionaliteit van CD4+Foxp3+ T-cellen. Het was opvallend dat er geen verschil werd gezien in de graad van insulitis tussen muizen die therapeutische reageerde en niet-reageerde, wat ook wijzigingen suggereert in andere immuuncel subsets behalve Tregs. Biomerkers geïdentificeerd in deze studie kunnen in de toekomst mogelijk gebruikt worden om de L. lactis-gebaseerde CT op maat te maken voor individuele patiënten.

Verder hebben we het potentieel van deze CT buiten het moment van de acute diabetes diagnose onderzocht. Om dit te doen, hebben we auto-immuun diabetische NOD-muizen, met een ziekteduur variërend tussen 4 en 53 dagen, met syngene eilandjes aangevuld op het moment dat de therapie werd gestart. Onbehandelde ontvangers van eilandjes vertoonden consequent een herhaling van de ziekte na 8,2 ± 0,7 dagen, terwijl 32% van de met aCD3-behandelde en 48% van de met CT-behandelde muizen bleven normoglycemisch tot 6 weken na de start van de therapie. Echter, muizen die meer dan 2 weken diabetisch waren voor het begin van de behandeling, waren minder efficiënt in het behouden van normoglycemie dan de muizen die binnen 2 weken na de diagnose werden behandeld. Dit effect was meer uitgesproken in de met aCD3 alleen behandelde groep. De efficiëntie van glycemische controle en tolerantie van het transplantaat in verhouding tot de duur van de ziekte alvorens therapie te starten is deels gerelateerd aan de door de therapie geïnduceerde bescherming van eventuele overblijvende endogene eilandjes, wat gemeten wordt door het insulinegehalte van de pancreas te bepalen.

De volledige eliminatie van endogene bètacelmassa met alloxaan op het moment van diabetesdiagnose wees op het belang van continue toediening van het eilandjesantigeen PINS samen met aCD3 therapie voor een succesvolle behandeling. De CT met PINS beschermt 60% van de muizen, vergeleken met slechts 17% wanneer een irrelevant antigeen (ovalbumine) wordt gecombineerd met aCD3, of 17% met alleen aCD3-therapie. De aanhoudende tolerantie door alleen aCD3-therapie of de CT ging gepaard met een vermindering van IGRP+CD8+ autoreactieve T-cellen en een toename van Foxp3+CD4+ Tregs. Na CT met PINS werd echter een specifieke accumulatie van Foxp3+ Tregs rond de insuline bevattende eilandjes waargenomen. Samen genomen laten deze gegevens zien dat de combinatie therapie van proinsuline en IL-10 via orale L. lactis met een lage dosis aCD3, de tolerantie voor bètacellen bij auto-immuun diabetische muizen kan herstellen, ook wanneer de therapie wordt gestart buiten het venster van de acute diabetes diagnose.

De algemene conclusie is dat de data die in dit proefschrift worden gepresenteerd, hielpen bij het ontwerpen van een fase Ia/IIb klinische studie voor patienten met nieuw gediagnosticeerde T1D. Hierbij wordt de veiligheid en verdraagbaarheid van klinische inzetbare LL-PINS+IL-10 beoordeeld alleen of in combinatie met Teplizumab.  We hopen dat deze bevindingen kunnen worden bevestigd in een menselijke omgeving en dat ze zullen bijdragen aan de verwezenlijking van het klinische potentieel.