< Terug naar vorige pagina

Project

Elektrische impedantie spectroscopie en 3D celculturen als opkomende technologieën voor het bestuderen van signaaltransductiewegen: het merkwaardige geval der cathelicidines

Dit doctoraatsproefschrift bestaat uit twee belangrijke delen. Het eerste gedeelte handelt over het ophelderen van signaaltransductiewegen van recent ontdekte potentiële bioactieve peptiden. Het tweede gedeelte introduceert 3D celcultuursystemen en weidt uit over verschillen in genexpressie tussen 2D en 3D celculturen gebruik makende van RNA-sequencing.

Bioactieve peptiden verrichten talloze functies in meercellige organismen als belangrijke spelers in cellulaire communicatie. Ze zijn betrokken in de regulering van verschillende biochemische en biofysische processen, zoals celgroei, celmetabolisme, reproductie, en homeostase. Endogene peptiden kunnen over een korte afstand een signaal doorgeven (zogenaamde auto- of paracriene activiteit) of over een lange afstand (endocriene signalering). Ongeacht het signaleringsbereik geven peptiden meestal hun signaal door via interactie met een receptorproteïne dat op doelwitcellen tot expressie komt. Zowel het peptide als de receptor zijn mogelijke therapeutische doelwitten in het geval het peptide in een bepaald fysiologisch of pathologisch proces betrokken is.

Voortdurende verbeteringen in peptidenextractiemethodes en massaspectrometrie-gebaseerde technieken stelde onderzoekers in staat om endogene peptiden te identificeren in complexe biologisch mengsels zoals weefselextracten. Via het aanpassen van peptidomicstechnieken die eerder voor invertebraten gebruikt werden, was het laboratorium van prof. Schoofs in staat om systematisch de sequentie van meer dan 1000 nieuwe potentiële bioactieve peptiden in verschillende muizen- en humane weefsels te ontdekken. Hiervan werden er uiteindelijk ongeveer 700 synthetisch geproduceerd met als doel de mogelijke functie van deze peptiden te achterhalen.

Om na te gaan of de kandidaatpeptiden enige activiteit vertoonden, werden ze getest op een verzameling celculturen die representatief zijn voor verschillende humane of muizenceltypes. In een eerste fase van het onderzoek gebeurden deze zogenaamde screeningsexperimenten via elektrische impedantie spectroscopie, een techniek die in staat is om een cellulaire respons te detecteren ongeacht welke intracellulaire signaaltransductieweg geactiveerd wordt. Eens er een respons gedetecteerd werd na toevoeging van een kandidaatpeptide, werden verdere experimenten uitgevoerd gebruik makende van farmacologische agentia om het moleculair doelwit van het peptide te identificeren en het werkingsmechanisme bloot te leggen.

Screeningexperimenten toonden aan dat de kwaliteit van kandidaatpeptiden erg belangrijk is om resultaten correct te kunnen interpreteren, aangezien verschillende effecten bekomen met onzuivere (< 70%) peptiden niet gereproduceerd konden worden met peptiden van een hogere zuiverheid. Desondanks werden er een aantal zuivere peptiden geïdentificeerd die biologisch actief waren, wat ruime perspectieven bood om hun werkingsmechanisme te bestuderen.

Onze focus lag hoofdzakelijk op één peptide genaamd P318. P318 is een nieuw peptidenfragment gevormd uit het cathelicidine-verwante antimicrobieel peptide (CRAMP). Cathelicidines spelen een belangrijke rol in het immuunsysteem aangezien ze zowel immunomodulerende als directe antimicrobiële activiteit vertonen. Het best bestudeerde lid van de cathelicidinefamilie is waarschijnlijk LL-37, het enige humane cathelicidinepeptide dat tot op heden geïdentificeerd werd. Verschillende studies suggereren dat LL-37 zijn pleiotrope effecten uitoefent door te interageren met verschillende structureel onverwante receptoren en/of intracellulaire doelwitten in verscheidene cellijnen. Desalniettemin zijn nog niet alle moleculaire details waarmee LL-37 zijn effecten uitoefent op gastheercellen volledig begrepen. Gezien LL-37 een belangrijke rol vervult in het immuunsysteem, is het van groot belang om een beter inzicht te krijgen in de verschillende werkingsmechanismen.

Impedantiemetingen toonden aan dat zowel LL-37 als P318 in staat waren om een respons in een brede waaier celtypes te induceren. We merkten verder op dat verschillende cellijnen een unieke impedantierespons tegen LL-37 of P318 hadden, wat erop kan wijzen dat LL-37 en P318 verschillende signaaltransductiewegen kunnen activeren. Verdere experimenten met farmacologische agentia lijken deze hypothese te bevestigen. Zo brengt LL-37 de mobilisatie van calcium teweeg in HEK293T cellen via activatie van de PLC-IP3R signaaltransductieweg. Sterke aanwijzigingen werden vervolgens gevonden dat LL-37 met het celmembraan interageert i.p.v. een specifieke interactie met een receptor. Dit in tegenstelling tot het effect van LL-37 op RAW264.7 macrofagen en A549 longcarcinoomcellen, waar een tot op heden ongekende Gi-gekoppelde receptor(en) een rol speelt in het werkingsmechanisme. Opmerkelijk genoeg lijken ook endocytosepaden in A549 cellen betrokken in het werkingsmechanisme van LL-37.

Hoewel er verschillende parallelle effecten van LL-37 en P318 werden waargenomen (b.v. in HEK293T cellen), lijkt P318 een andere manier te gebruiken dan LL-37 om een respons in B16 melanoomcellen te induceren. In deze cellen verhoogt P318 (en niet LL-37) de concentratie van cAMP en veroorzaakt hyperpolarisatie van het celmembraan, waarna het signaal wordt verdergezet via een Akt-afhankelijke signaaltransductieweg.

In het finale gedeelte van dit doctoraatsproefschrift werden 3D celculturen voorgesteld aangezien zij de complexe in vivo biologie van cellen en weefsels beter nabootsen dan 2D celculturen. Verschillende studies rapporteren over verschillen in gen- en proteïne-expressie tussen 3D en 2D celculturen. Deze verschillende genexpressieprofielen kunnen tot verschillen in receptorexpressie leiden, wat een gevariëerde respons op kandidaat-geneesmiddelen kan veroorzaken. Tot op heden is er echter geen makkelijk toegankelijk overzicht van deze verschillen in receptorexpressie te vinden in de literatuur. Daarom gebruikten wij RNA-sequencing om differentiële receptorexpressie te meten tussen 2D en 3D HT-29 colorectale carcinoomcellen. 17 GPCRs en verscheidene klinisch relevante RTKs en ionenkanalen werden geïdentificeerd die differentieel tot expressie kwamen. Hiernaast toonden we ook aan dat een aantal signaleringspaden verschilden tussen HT-29 sferoïden en 2D celculturen, inclusief paden die geassocieerd worden met de progressie van de celcyclus en glucosemetabolisme.

 

Datum:1 okt 2012 →  20 dec 2017
Trefwoorden:electrical impedance spectroscopy, bioactive peptides, LL-37, 3D cell cultures
Disciplines:Sensoren, biosensoren en slimme sensoren, Andere elektrotechniek en elektronica, Systeembiologie
Project type:PhD project