< Terug naar vorige pagina

Project

Experimentele evolutie in Candida biofilms: faciliteert drug tolerantie de ontwikkeling van drug resistentie in schimmels?

Invasieve schimmelinfecties vormen een ernstige en groeiende bedreiging voor de volksgezondheid, waarbij het falen van de behandeling en het sterftecijfer vaak 50% overschrijden. Er zijn slechts drie klassen antischimmelgeneesmiddelen beschikbaar voor de behandeling van systemische schimmelinfecties en de resistentie tegen deze geneesmiddelen is de afgelopen jaren aanzienlijk toegenomen. Bovendien zijn multidrug resistente (MDR) 'superbugs' zoals Candida auris opgedoken. Ondanks deze alarmerende problemen blijven schimmelinfecties en de resistentiecrisis onderbelicht wat betreft aandacht in onderzoek, medicijnontwikkeling en media. C. auris is een opportunistische pathogene gist die in 2009 voor het eerst als nieuwe soort werd geïdentificeerd. Sindsdien is het gelijktijdig opgedoken over heel de wereld en in vijf verschillende clades die geassocieerd worden met een primaire geografische oorsprong en clade-specifieke fenotypische kenmerken. Gezien de recente opkomst van C. auris vormen nauwkeurige identificatie en diagnose een grote uitdaging, wat epidemiologisch onderzoek en management van infecties bemoeilijkt. Daarnaast vertoont C. auris een unieke aanleg tot nosocomiale overdracht, wat leidt tot ziekenhuisuitbraken van dodelijke candidemie. Maar het meest urgente probleem bij C. auris infecties is de ongekende mate van resistentie. Bij aanvang van het onderzoek gepresenteerd in dit werk waren er weinig resistentie mechanismen gekarakteriseerd in C. auris. Daarom was het primaire doel van ons onderzoek om te achterhalen hoe C. auris zich kan aanpassen aan behandeling, en hoe we dit kunnen vermijden.

In onze eerste studie maakte we gebruik van een nieuwe methode in onderzoek naar MDR in C. auris, namelijk experimentele evolutie om resistentie-ontwikkeling tegen geneesmiddelen uit de drie belangrijkste klassen en combinaties hiervan, te bestuderen. Na genoom analyse van geselecteerde resistente stammen, onderzochten we opeenvolgende mutanten met allelspecifieke PCR (AS-PCR). We onthulden de accumulatie van nieuwe aneuploïdieën en mutaties in zowel bekende genen gekoppeld aan resistentie, als nieuwe factoren. We toonden het eerste verworven amphotericine B resistentiemechanisme in C. auris aan, naast nieuwe FKS1 mutaties - inclusief een nieuwe FKS1 hotspot - gekoppeld aan echinocandine resistentie en chromosomale duplicaties die azool resistentie aansturen. Bovendien illustreerden we het vermogen van C. auris om snel resistentie te ontwikkelen, vaak met weinig tot geen fitness trade-offs, in een isolaat van een clade die niet vaak geassocieerd wordt met MDR.

De op AS-PCR gebaseerde screeningsmethode om mutaties te identificeren bleek een waardevol hulpmiddel en werd daarom vervolgens gebruikt in een proof-of-conceptstudie om C. auris en C. auris clades te identificeren. Omdat C. auris vaak verkeerd geïdentificeerd wordt in de kliniek en er weinig eenvoudige typeringsmethoden voor soort en clade bepaling beschikbaar zijn, karakteriseerde we genetische merkers en optimaliseerde we AS-PCR-assays om C. auris snel, goedkoop en zonder sequeneren te detecteren en te typeren, wat een nuttige diagnostische methode oplevert voor onderzoeksomgevingen met een laag budget.

Omdat accumulerend onderzoek naar de genetische determinanten van resistentie in C. auris aantoonde dat vooral de mechanismen van amphotericin B resistentie onverklaard bleven, onderzochte we vervolgens op grote schaal hoe amphotericin B-resistentie kan worden verworven door C. auris. We typeerden 441 in vitro en in vivo geëvolueerde C. auris-stammen van vier amphotericin B-gevoelige klinische isolaten uit verschillende clades. We toonden een grote diversiteit aan verworven resistentie-responsen met resistentieomvang- en clade-afhankelijke fitness trade-offs. Genotypering en membraansterolanalyses van geselecteerde stammen laten vier typen membraansterolveranderingen zien die betrokken zijn bij verworven amphotericin B-resistentie. Met behulp van een nieuwe CRISPR-Cas9 methode en Cas9-RNP-gen deleties, toonde we aan dat amphotericin B-resistentie kan worden verkregen door modificatie in verschillende regulatoren van de biosynthese van sterolen, waaronder ERG6, NCP1, ERG11, ERG3, HMG1, ERG10 en ERG12. Daarnaast werden duplicaties van chromosomen 4 en 6 waargenomen, wat het eerst beschreven geval is van aneuploïde aangedreven polyeenresistentie. Door gebruik te maken van fitness trade-off fenotypering en wiskundige modellering van de in vivo omgeving tijdens de behandeling, evalueerden we het potentieel van verschillende amphotericin B-resistentiemechanismen om resistente infecties tot stand te brengen. Hieruit werd duidelijk dat vooral ERG6 modulatie in staat is om amphotericin B resistentie te verwerven tijdens infecties. Verder ontdekte we het eerste fitness trade-off compensatiemechanisme in geneesmiddelresistentie van pathogene schimmels, waarbij variatie in CDC25 het verlies aan fitness als gevolg van een defect ERG6 gen compenseert. Hierdoor neemt het potentieel om een resistente infectie tot stand te brengen aanzienlijk toe. Dit fitness-compensatiemechanisme zou het enige gerapporteerde geval van verworven amphotericin B-resistentie in de kliniek vergemakkelijkt kunnen hebben.

In de eerder genoemde experimentele evolutiestudies observeerde we twee interessante fenomenen: collaterale sensitiviteit (CS); het proces waarbij resistentie tegen één geneesmiddel leidt tot een verhoogde gevoeligheid voor een ander geneesmiddel, en kruisresistentie (XR); de verminderde gevoeligheid voor meerdere geneesmiddelen na blootstelling aan één enkel geneesmiddel. CS en XR waren dusver nog niet onderzocht bij pathogene schimmels, maar zijn wel uitgebreid bestudeerd bij bacteriën en kanker, waar ze een rol spelen bij het herontwerpen van behandelingen om resistentieontwikkeling te voorkomen of te verminderen. We karakteriseerden CS en XR tendenzen met behulp van in vitro experimentele evolutie van de C. auris type stam in negen antischimmelmiddelen en daaropvolgende gevoeligheidsscreening van resistente isolaten tegen 19 antischimmelmiddelen. Naast intra-klasse XR, observeerden we XR tussen azolen en echinocandines, en tussen azolen en amphotericin B. Aangezien dit de belangrijkste klassen van geneesmiddelen zijn die gebruikt worden bij de behandeling van C. auris infecties, is verder onderzoek naar de robuustheid en klinische relevantie van XR in het falen van behandelingen erg belangrijk. CS was het duidelijkst in amphotericin B-resistente isolaten, met een verhoogde gevoeligheid voor flucytosine, geldanamycine en echinocandines. Vervolgens toonden we aan dat CS kan worden ingezet om resistentieontwikkeling te voorkomen en te verminderen door het cyclisch of gecombineerd toedienen van geneesmiddelen die CS vertonen. Verder optimaliseerde we een wiskundig model om de populatiedynamiek van infecties tijdens de behandeling te simuleren in 'virtuele patiënten'. Dit model voorspelde dat deze CS-gebaseerde alternatieve behandelingsschema's de resistentieontwikkeling ook in de in vivo context aanzienlijk verminderen, vooral bij korte cycli. Om te onderzoeken of een geneesmiddel dat CS uitoefent, bestaande resistente subpopulaties kan elimineren, optimaliseerden we een competitie-experiment waarin resistente en vatbare subpopulaties kunnen worden getraceerd door een selectieve merker te integreren in een neutrale genomische locus voor C. auris die we karakteriseerde. In vitro competitie-experimenten toonden aan dat resistente subpopulaties weg worden geconcureerd na toediening van een CS-bevorderend geneesmiddel. Dit suggereert dat, naast het voorkomen van resistentie, CS veelbelovend is om bepaalde resistente infecties effectief te behandelen. De verdere validatie van CS gebaseerde alternatieve behandelingen bij verschillende stammen en soorten vormen een veelbelovende weg voor toekomstig onderzoek en kunnen mogelijk een revolutie teweegbrengen in de behandeling van MDR-schimmelpathogenen zoals C. auris.

Concluderend benadrukt dit onderzoek de potentie van resistentie bij C. auris door diverse en nieuwe moleculaire resistentiemechanismen aan het licht te brengen die een effectieve behandeling in de weg kunnen staan. Inzicht in deze evolutionaire mechanismen kan echter een veelbelovende weg zijn voor het ontwikkelen van innovatieve behandelingen om MDR te bestrijden en moedigt toekomstig onderzoek aan.

Datum:1 okt 2019 →  15 dec 2023
Trefwoorden:evolution, drug resistance, fungi
Disciplines:Mycologie, Genetica
Project type:PhD project