< Terug naar vorige pagina

Project

Formulatie van hydrofobe anti-kanker geneesmiddelen in intelligente polymeer nanopartikels

Deze thesis heeft zich gefocust op het design van polymeer-gebaseerde dragersystemen met als doel
zowel de oplosbaarheid als de afgifte van taxaan anti-kankergeneesmiddelen te verbeteren. DEEL I van deze thesis omvat een algemene inleiding waarbij de behoefte aan geavanceerde chemotherapie in kaart wordt gebracht.
Hoofdstuk 1 beschrijft de therapieën tegen kanker die heden in de kliniek worden aangewend. De nadruk wordt vooral gelegd op conventionele chemotherapie en de problematiek met betrekking tot toxiciteit. Zo wordt ook de nood aan een veiligere en efficiëntere afgifte van anti-kankergeneesmiddelen geïllustreerd. Vervolgens worden de basisbegrippen en troeven van nanomedicijnen (bijvoorbeeld passieve en actieve U+2018targetingU+2019, bioresponsieve vrijstelling van geneesmiddelen) uiteengezet en aldus de opportuniteiten van dit onderzoeksveld om alternatieve
formulatiestrategieën te ontwikkelen voor verbeterde afgifte van anti-kankergeneesmiddelen. In Hoofdstuk 2 wordt de achtergrond van taxanen geschetst, samen met de eerste formulaties die hiervan op de markt werden gebracht. Eerst wordt de ontdekking en vroegtijdige ontwikkeling van paclitaxel (PTX) en docetaxel (DTX) beschreven. Vervolgens wordt een overzicht gegeven van de verschillende bronnen, grondstoffen en technieken voor de productie van taxanen. Het werkingsmechanisme wordt uitgelegd en ten slotte worden ook de fysicochemische eigenschappen van Taxol en Taxotere opgegeven, samen met het gebruik van deze formulaties in
de kliniek en de gerelateerde neveneffecten.
DEEL II beschrijft het verrichte experimentele werk omtrent de ontwikkeling van twee polymeergebaseerde, nanoscopische dragersystemen voor fysische encapsulatie van geneesmiddelen. Hoewel in deze thesis telkens PTX werd gebruikt, kunnen beide systemen in de toekomst ook nog met andere hydrofobe geneesmiddelen getest worden. In Hoofdstuk 3 wordt de formulatie van poly(glycerol sebacate) (PGS) nanopartikels beschreven.
Hiervoor werd een eenvoudig formulatieprotocol opgesteld op basis van U+2018solvent displacementU+2019. PTX en PGS werden samen opgelost in ethanol (EtOH) en vervolgens werd deze oplossing druppelsgewijs en onder roeren toegevoegd aan water (H2O). Een belangrijke troef van deze formulatie is de biocompatibiliteit van de gebruikte excipiëntia (PGS, EtOH en H20), wat cruciaal is voor systemen die bestemd zijn voor biomedische toepassing. Door middel van dynamische lichtverstrooiing (DLS) werden partikels met afmetingen niet groter dan 200 nm gedetecteerd, die gekenmerkt worden door een geringe polydispersiteit en hoge colloïdale stabiliteit in fysiologisch waterig midden. Bovendien werd een zeer lage kritische aggregatie concentratie (CAC) gemeten (< 1 U+03BCg/mL). Dit wijst erop dat de gevormde partikels niet snel uiteen zullen vallen bij substantiële verdunning. Flow cytometrie (FACS) en confocale microscopie hebben aangetoond dat hydrofobe componenten na encapsulatie in
PGS nanopartikels efficiënt kunnen worden afgegeven aan kankercellen in vitro. Ten slotte werd via MTT assay vastgesteld dat PTX/PGS nanopartikels de viabiliteit van kankercellen in dezelfde mate kunnen inperken als 2 commerciële, geavanceerde PTX formulaties (Abraxane en Genexol-PM). Zoals verwacht werd geen intrinsieke cytotoxiciteit vastgesteld voor onbeladen PGS nanopartikels. Deze in vitro data vormen een goed onderbouwde basis voor verdere in vivo evaluatie. Echter, tot op heden kon enkel een matige PTX concentratie (0.5 mg/mL) verkregen worden in de ontwikkelde formulatie. Het systeem vereist dus nog verdere optimalisatie om de geneesmiddelbelading te verhogen. Op die manier kan een klein volume formulatie over een adequate dosis PTX
beschikken, wat de formulatie toegankelijker maakt voor toediening (intraveneus, intraperitoneaal) aan patiënten. Hoofdstuk 4 beschrijft het systematische design van amfifiele, zuur-degradeerbare, blok copolymeer nanopartikels, gesynthetiseerd via U+2018reversible addition-fragmentation chain transferU+2019 (RAFT) polymerisatie. Om een bioresponsief, zuurgevoelig hydrofoob blok te verkrijgen, werd een hydrofoob, ketal-gefunctionaliseerd acrylaat monomeer ((2,2-dimethyl-1,3-dioxolane-4-yl)methyl acrylaat (DMDMA)) gecopolymeriseerd met een hydrofiel monomeer (hydroxyethyl acrylaat (HEA)). Door de DMDMA:HEA molaire ratio te variëren, werden 5 verschillende blok copolymeren gesynthetiseerd met een toenemende fractie DMDMA in het hydrofobe blok. Vervolgens werd de
invloed van de samenstelling van het hydrofobe blok op de fysicochemische eigenschappen van het polymeer onderzocht. Polymeren met een DMDMA fractie hoger dan 11 mol % vormen spontaan nanopartikels in waterig midden. De nanopartikels vertoonden hoge colloïdale stabiliteit in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). De grootte en de CAC van de partikels varieerde respectievelijk van 23 tot 338 nm en van 241 tot 10 U+03BCg/mL, evenredig met de molaire fractie DMDMA. Onder zure condities degradeerden de nanopartikels tot wateroplosbare unimeren. De degradatiesnelheid was omgekeerd evenredig met de molaire fractie DMDMA. FACS en confocale microscopie
hebben in vitro aangetoond dat de ontwikkelde nanopartikels kunnen aangewend worden als dragersysteem voor efficiënte afgifte van hydrofobe geneesmiddelen aan kankercellen. De blok copolymeren zelf vertoonden geen samenvatting en algemene conclusies intrinsieke cytotoxiciteit. Echter, wanneer de nanopartikels werden beladen met PTX, kon de viabiliteit van kankercellen in dezelfde mate gereduceerd worden als met Abraxane en Genexol-PM. Het doel van deze studie was
vooral om na te gaan of RAFT toelaat om gedefinieerde, responsieve dragersystemen voor geneesmiddelafgifte te ontwikkelen. In dit opzet werd geslaagd. Echter, in dit stadium is het systeem nog niet geschikt voor verdere in vivo evaluatie. Aanpassingen in polymeerdesign moeten worden overwogen om nanopartikels te verkrijgen met een snellere degradatiekinetiek bij fysiologisch relevantere pH-waarden (5 U+2013 6.5), met een hogere geneesmiddelbelading en met behoud van partikelintegriteit bij substantiële verdunning. Dit zou kunnen worden verwezenlijkt door de nanopartikels te crosslinken enerzijds en anderzijds door het geneesmiddel chemisch te
koppelen aan het dragersysteem. Chemische conjugatie van geneesmiddelen aan polymere dragers is een erkende techniek voor de ontwikkeling van geavanceerde formulaties voor anti-kankergeneesmiddelen. Door middel van chemische conjugatie kan versnelde geneesmiddelvrijstelling in de bloedbaan in grotere mate ingeperkt worden in
vergelijking met fysische encapsulatie, wat toelaat om ongewenste neveneffecten verder te onderdrukken. DEEL III omvat het tweede experimentele luik van deze thesis en beschrijft een nieuwe designstrategie voor de aanmaak van taxaan-polymeer conjugaten op basis van een U+2018grafting-from-drugU+2019 RAFT approach. In Hoofdstuk 5 wordt de synthese en evaluatie van de U+2018eerste-generatieU+2019, ester-gebaseerde PTX-polymeer prodrug conjugaten beschreven.
Een RAFT U+2018chain transfer agentU+2019 (CTA) werd regioselectief gekoppeld aan de C2U+2019 hydroxyl groep van PTX. Deze is cruciaal voor de biologische activiteit van PTX. De PTX-gefunctionaliseerde RAFT CTA werd vervolgens aangewend voor de polymerisatie van het hydrofiele monomeer N,N dimethylacrylamide (DMA). Gedefinieerde, amfifiele PTXpolymeer conjugaten werden verkregen met een hoge geneesmiddelbelading (20 wt % PTX) en wateroplosbaarheid (t 30 mg/mL conjugaat). Na dispergeren in PBS werden via DLS stabiele micellen gedetecteerd, met een grootte van 27 nm en een lage polydispersiteit. De relatief hoge CAC (102 U+03BCg/mL) van de conjugaten impliceert dat deze micellen bij substantiële verdunning in waterig midden zullen uiteenvallen.
Aanvullende modificatie werd verricht door U+03C9-eindgroep post-functionalisatie met een fluorescente U+2018tracerU+2019 molecule. In vitro experimenten hebben aangetoond dat de conjugaten snel door kankercellen worden opgenomen via endocytose. Vanuit deze endosomen kan PTX vrijgesteld worden en vervolgens zijn subcellulair doelwit (microtubuli) bereiken. De conjugaten vertoonden een gelijkaardig cytotoxiciteitsprofiel in vergelijking met systemen, gebaseerd op louter fysische encapsulatie (Abraxane en Genexol-PM). Deze resultaten vormen een goede basis voor verdere in vivo evaluatie, vooral omdat de hoge geneesmiddelbelading toelaat om een adequate dosis PTX toe te dienen. De keuze van een geschikt in vivo muismodel zal hierbij wel cruciaal zijn. Conventionele
muismodellen op basis van een primaire subcutane tumor kunnen mogelijks niet ten volle het potentieel van dit systeem vaststellen, omdat deze wateroplosbare conjugaten met laag molecuulgewicht niet in grote mate passief zullen accumuleren in tumorweefsel door middel van het U+2018enhanced permeability and retentionU+2019 (U+2018EPRU+2019) effect. Een klinisch relevanter model (orthotopisch/metastatisch muismodel) is mogelijks geschikter om te onderzoeken of
deze kleine conjugaten in vergelijking met nanopartikels efficiënter zijn in het doordringen van tumorweefsel, dat gekenmerkt wordt door een beperkte doorbloeding en/of door fysiologisch normaal afgelijnd endotheel. Om deze proeven te kunnen verrichten zal het essentieel zijn om samen te werken met onderzoeksgroepen die beschikken over de nodige expertise.
Hoofdstuk 6 handelt over de ontwikkeling van U+2018tweede-generatieU+2019 PTX-polymeer conjugaten, gebaseerd op dezelfde approach zoals beschreven in Hoofdstuk 5. Er werd hiervoor gebruik gemaakt van de opgebouwde expertise omtrent acetal/ketal synthese, beschreven in Hoofdstuk 4, om conjugaten te verkrijgen met zuurgevoelige vrijstellingseigenschappen. PTX werd gekoppeld aan een RAFT CTA, zowel via een cyclische als via een lineaire acetalgroep. In tegenstelling tot de regioselectieve estervorming met PTX, beschreven in Hoofdstuk 5, kan rechtstreekse acetalisatie gebeuren op 2 posities van PTX: ofwel op de C2U+2019 of op de C7 hydroxyl groep. Deze
chemische koppelingsreactie geeft dus aanleiding tot 2 regio-isomeren van PTX-gefunctionaliseerde RAFT CTA. De isomeren op basis van het cyclische acetal konden van elkaar gescheiden worden via silica gel chromatografie. De isomeren op basis van het lineaire acetal konden als regio-isomeer mengsel worden gebruikt in de daaropvolgende polymerisatiestap. De eigenschappen van de verkregen PTX-polymeer conjugaten waren in overeenstemming met deze van de U+2018eerste-generatieU+2019 conjugaten met betrekking tot polymeerdefinitie, geneesmiddelbelading en wateroplosbaarheid. Zowel de U+2018eerste-U+2018 als de U+2018tweede-generatieU+2019 conjugaten vertoonden geen versnelde vrijstelling in PBS, zowel in aan- als in afwezigheid van 10 % foetaal kalfsserum (FBS). Bij pH 4 en 5 werd een significante vrijstelling van PTX vastgesteld voor de conjugaten op basis van het lineaire acetal.
Vrijstelling was beperkt en afwezig bij pH 4 en 5 voor de conjugaten op basis van het cyclische acetal en de U+2018eerstegeneratieU+2019 conjugaten, respectievelijk. De celviabiliteit kon in dezelfde mate worden teruggedrongen als met de U+2018eerste-generatieU+2019 conjugaten, echter hogere concentraties waren vereist. Een concentratie, hoger met ongeveer factor 102 en 103 was vereist voor de conjugaten op basis van het lineaire en cyclische acetal, respectievelijk. Deze data tonen duidelijk aan dat het lineaire acetal zuurgevoeliger is dan het cyclische acetal, en dat de vrijstelling van PTX uit de U+2018eerste-generatieU+2019 conjugaten, op basis van esterkoppeling, hoogst waarschijnlijk via een enzymatisch
proces verloopt.

Wegens de kleine afmeting en hoge wateroplosbaarheid van deze conjugaten is het onwaarschijnlijk dat deze in vivo lang in de bloedbaan zullen circuleren en efficiënt via U+2018EPRU+2019 zullen accumuleren in tumorweefsel. Echter, vlotte renale klaring van de fractie geneesmiddel die het tumorweefsel niet bereikt, kan een belangrijke troef zijn voor reduceren van systemische neveneffecten. Om toch een adequate dosis van deze PTX-conjugaten met korte halfwaardetijd ter hoogte van tumorweefsel (minder onderhevig aan U+2018EPRU+2019 effect) te kunnen afgeven, moeten actieve U+2018targetingU+2019 strategieën overwogen worden. Hoofdstuk 7 omvat het design van DTX-polymeer prodrug conjugaten, uitgerust met een ligand voor actieve U+2018targetingU+2019. Door gebruik te maken van de designstrategie beschreven in Hoofdstuk 5, werd een DTX-gefunctionaliseerde RAFT CTA gesynthetiseerd en verder
gebruikt voor de aanmaak van gedefinieerde DTX-polymeer prodrug conjugaten. Bovendien werd S,S-2-(3-(5- amino-1-carboxypentyl)-ureido)-pentanedioic acid (ACUPA) gesynthetiseerd. Dit ligand heeft een hoge bindingsaffiniteit voor prostaat specifiek membraan antigen (PSMA), een receptor die tot overexpressie wordt gebracht door maligne prostaat kankercellen. ACUPA werd verder gemodificeerd met een maleimide eindgroep en vervolgens gebruikt voor de post-modificatie van de DTX-polymeer prodrug conjugaten. De synthese van ACUPAgefunctionaliseerde DTX-polymeer prodrug conjugaten kon worden bevestigd via U+2018size exclusionU+2019 chromatografie (SEC) en nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie. Fluorescent gelabelde analogen konden worden aangemaakt door een kleine fractie fluorescent monomeer mee te laten reageren tijdens de polymerisatiestap. Als
controle werden DTX-polymeer prodrug conjugaten aangemaakt, gefunctionaliseerd met een eindgroep die niet specifiek bindt met PSMA. FACS heeft aangetoond dat de DTX-polymeer-ACUPA prodrug conjugaten in grotere mate interageren in vitro met PSMA-positieve prostaat kankercellen in vergelijking met de controle. Aanvullende in vitro experimenten (confocale microscopie, competitieve bindingsexperimenten, MTT) zullen moeten aantonen of DTXpolymeer-ACUPA, in vergelijking met de controle, al dan niet op efficiënte wijze hogere dosissen DTX kan afgeven aan PSMA-positieve prostaat kankercellen via receptor-gemedieerde endocytose en of dit leidt tot hogere en
selectievere cytotoxiciteit.
Samengevat werden gedurende deze thesisperiode meerdere design-, synthese- en formulatiestrategieën onderzocht en uitgewerkt, met als doel geavanceerde polymere formulaties te ontwikkelen voor zowel passieve als actieve U+2018targetingU+2019 van taxaan anti-kankergeneesmiddelen. Ondanks de eenvoud van U+2018solvent displacementU+2019 en de hoge definitie van de partikels die met deze techniek werd verkregen, kon tot nu toe nog geen adequate geneesmiddelbelading worden verwezenlijkt. Er werd aangetoond dat RAFT een controleerbare en chemische veelzijdige polymerisatietechniek is voor het ontwerpen van gedefinieerde, bioresponsieve dragersystemen voor
geneesmiddelen. De U+2018grafting-from-drugU+2019 approach blijkt veelbelovend te zijn. Deze eenvoudige synthesestrategie geeft aanleiding tot polymere taxaan prodrug conjugaten met hoge geneesmiddelbelading en beperkte versnelde vrijstelling in vitro. De succesvolle post-modificatie met een ligand voor actieve U+2018targetingU+2019 benadrukt verder de veelzijdigheid van deze syntheseroute. De kleine afmeting van deze wateroplosbare conjugaten kan ertoe leiden dat deze efficiënter kunnen binnendringen in (metastatisch) tumorweefsel dat minder onderhevig is aan passieve U+2018targetingU+2019 door U+2018EPRU+2019. Dit kan worden nagegaan in vivo, op voorwaarde dat hiervoor een geschikt en klinisch
relevant muismodel wordt gebruikt. Toekomstige in vitro en in vivo experimenten zullen verder moeten uitmaken of deze approach ook geneesmiddelen selectiever kan afgeven via actieve U+2018targetingU+2019. Kortom, in deze thesis werden waardevolle inzichten verschaft die van belang kunnen zijn voor toekomstig rationeel design van geavanceerde polymere dragersystemen voor fysische encapsulatie en chemische conjugatie van antikankergeneesmiddelen.

Datum:1 jan 2013 →  31 dec 2016
Trefwoorden:anti-kanker geneesmiddelen, geavanceerde chemotherapie
Disciplines:Farmacologie, Andere farmaceutische wetenschappen, Ontdekking en evaluatie van biomarkers, Toxicologie en toxinologie, Farmacognosie en fytochemie, Ontdekking en evaluatie van geneesmiddelen, Farmacotherapie, Farmaceutica, Medicinale producten