Genoomwijde analyse van differentiële genexpressie gedurende de hematopoïetische ontwikkeling om nieuwe factoren die de functie van hematopoïetische stamcellen beïnvloeden te identificeren

De twee voornaamste kenmerken van stamcellen zijn zelfvernieuwing en differentiatie. Hematopoïetische stamcellen (HSC) zijn multipotente stamcellen die een leven lang verantwoordelijk zijn voor de productie van onze bloedcellen. Transplantatie van deze hematopoïetische stamcellen is een efficiënte methode voor de behandeling van hematopoïetische ziektes zoals bijvoorbeeld leukemie alsook immunodeficiënte pathologieën. De eeste transplantatie is meer dan 50 jaar geleden uitgevoerd1. Tot op de dag van vandaag worden er meer dan 30.000 autologe en 15.000 allogene transplantaties uitgevoerd per jaar2. Beenmerg (BM), gemobiliseerd perifeer bloed (MPB) en navelstrengbloed (UCB) zijn de drie belangrijkste bronnen van HSC. Ook al kunnen HSC transplantaties van een significante fractie van patiënten genexen zijn er limitaties, zoals de beschikbaarheid van een geschikte donor, graft versus host ziekte en vertraagde bloed cell generatie na transplantatie.

Het proces om een geschikte donor te vinden met weefselcompatibele antigenen is vaak een uitdaging. In dit opzicht bieden HSC afkomstig van navelstrengbloed een alternatieve bron voor transplantatie met minder limitaties m.b.t. weefselcompatibiliteit in vergelijking met BM transplantaties3. Eén van de problemen bij het gebruik van navelstrengbloed als bron, is het gelimiteerd aantal HSC per unit, waardoor één unit van navelstrengbloed niet voldoende is om een volwassen patiënt te behandelen4-6. Men hyptheseerd dat verschillende methodse deze limitatie kunnenn verhelpen, zoals ex vivo expansie van HSC of het verbeteren van de homing capaciteiten van deze cellen. Ondanks het feir dat er veel geweten is over het proces van de zelfvernieuwing en expansie van HSC in vivo, is dit nog steeds een groot probleem in vitro en dusdanig ook de meest limiterende factor om deze cellen grootschalig te kunnen benutten.

Tijdens de ontwikkeling worden HSC teruggevonden op verschillende locaties in het embryo en de foetus alvorens te migreren naar het beenmerg, de voornaamste locatie van hematopoïese. In volwassen beenmerg vind men voornamelijk “long-term repopulating” HSC die niet meer delen en zich in het G0 stadium van de cel cyclus bevinden, terwijl men tijdens de ontwikkleing, in de foetale lever, wel expanderende HSC terugvindt. omwillen van deze verschillien in spontane proliferatie tussen beenmerg en foetale lever HSC, focust deze studie  

zich op het onderzoeken van de HSC en hun niche tijdens de hematopoïetische ontwikkeling in de fetale lever. Zowel intrinsieke als extrinsieke factoren kunnen de zelfvernieuwing van HSC beïnvloeden. Om de belangrijkste factoren te ontdekken die deze zelfvernieuwing en proliferatie van HSCs beïnvloeden hebben we een transcriptoom analyse van het gehele genoom van zowel HSC als hun niche uitgevoerd op verschillende stadia tijdens de ontwikkeling d.m.v. high throughput RNA-sequencing. De belangrijkste intrinsieke factoren van HSC zijn bepaald door vergelijking van het genexpressie profiel van HSC van de fetale lever versus deze van volwassen beenmerg, zijnde de proliferatieve en quiescente fase respectievelijk. Vervolgens zijn deze intrinsieke factoren verder gevalideerd om hun functionele rol in hematopoïese te ontdekken door gebruik van een flk1:GFP/gata1:dsRed dubbel transgene zebravislijn. In deze zebravissen zijn al hun bloedcellen en endotheelcellen fluorescent gelabeld. Door gebruik van deze lijn hebben we een tot voor kort onbekende rol van tdg, uhrf1, uchl5, en ncoa1 ontdekt m.b.t. hematopoïese.

Het merendeel van de studies van de niche van HSC is uitgevoerd in beenmerg en niet in de foetale lever, waar de prolifererende HSC terug te vinden zijn. Daarom bestudeerden we hier het transcriptoom van de niche, zijnde de cellen die zich in de directe omgeving van de HSC bevinden, in de foetale lever d.m.v. laser capture microdissectie van foetale lever van verschillende embryonale stadia zijnde E12.5, E14.5 en E16.5. Onze interesse ging uit naar de genen die verschillend tot expressie tussen deze verschillende stadia. Hiervan vertrekkend hebben we een nieuwe rol ontdekt voor VEGF-C en S100A8, die beiden in staat zijn om HSC te doen expanderen door recombinante proteïnen van deze toe te voegen in ex vivo HSC celculturen. Ondanks het feir dat we ex vivo expansie konden detecteren indien deze factoren werden toegevoegd, detecteerden we geen verbeterde repopulatie van het bloedsysteem na transplantatie. Dit gegeven moet verder onderzocht worden, zoals het effect van de factoren op homing en uitputting van HSC. Ten laatste hebben we ook de rol onderzocht van biologische pathways die verschilden tussen foetale lever E14.5 en BM HSC op basis van de genexpressie data van de RNA sequencing. De data toonden dat foetale lever HSC een verhoogde expressie hebben van genen die betrokken zijn in de oxidatieve phosphorylatie (OxPhos) en de Krebscyclus. De OxPhos pathway was al gekend als een oorzaak van de uitputting van BM HSC, maar deze pathway is nooit onderzocht in foetale lever HSC. Onze studie toont aan dat foetale lever HSCs ook gebruik maken van de OxPhos pathway alsook glycolyse, zonder uitputting van de HSC.

De resultaten in deze thesis voorzien belangrijke cruciaal voor het verder valideren van nieuwe transcriptiefactoren, extrinsieke groeifactoren en metabolische factoren in andere diermodellen van hematopoïese om zo tot een nieuwe en klinisch relevante methode te komen die de ex vivo expansie van HSC toestaat.