< Terug naar vorige pagina
Project
Gentherapeutische strategieën voor HIV/AIDS op basis van LEDGF/p75.
HIV is een lentivirus dat AIDS (Acquired immunodeficiency syndrome) veroorzaakt. Wereldwijd zijn meer dan 34 miljoen mensen met het virus geïnfecteerd. Onbehandeld leidt een infectie met HIV tot het falen van het immuunsysteem, waardoor de patiënt vatbaar wordt voor allerlei opportunistische infecties en finaal zal komen te overlijden. Antiretrovirale medicatie grijpt in op verschillende stappen van de replicatiecyclus van het HIV-virus en heeft het mogelijk gemaakt voor HIV-geïnfecteerde patiëntenom, mits behandeling, een zo goed als normaal leven te leiden. Echter, ondanks therapie blijft de levensverwachting lager in vergelijking met ongeïnfecteerde personen. Bovendien dient de antiretrovirale medicatie (momenteel nog) dagelijks te worden ingenomen, blijft er een risico van resistentie ontwikkeling en zijn er potentieel milde tot ernstige nevenwerkingen. Een preventief vaccin of een middel dat leidt tot de genezing van HIV is momenteel niet beschikbaar.
In deze thesis is ons vertrekpunt de HIV replicatiecyclus en zijn nauwe interactie met de gastheer. Door middel van fundamenteel wetenschappelijk onderzoek trachten we een beter inzicht te verkrijgen in de HIV replicatiecyclus om zo potentieel nieuwe doelwitten te identificeren en te valideren om finaal nieuwe (conventionele en/of minder conventionele) behandelingsstrategieën te ontwikkelen die complementair zijn aan de bestaande antiretrovirale middelen. In het bijzonder richten we onze aandacht in deze thesis op de rol vanhet cellulaire eiwit Lens epithelium-derived growth factor, kortweg LEDGF/p75, in de HIV replicatiecyclus. We relateren onze bevindingen met de ontwikkeling van LEDGINs, een nieuwe klasse van antiretrovirale medicatie gericht tegen de interactie tussen het virale integrase en LEDGF/p75, alsook met genetische varianten van LEDGF/p75 welke in patiënten werden geïdentificeerd om zo een brug te slaan tussen fundamenteel onderzoeken de klinische realiteit.
Integratie van het virale DNA in het genoom van de gastheer is een essentiële stap in de replicatie cyclus van het virus die ervoor zorgt dat de gastheercel voortaan de genetischeinformatie van het virus zal dragen en aanleiding kan geven tot de vorming van nieuwe viruspartikels. Het zorgt bovendien voor het ontstaan vaneen reservoir van cellen waarin HIV is gearchiveerd, die ontsnappen aanhet immuunsysteem en waar het mogelijk is voor het virus om, eens antiretrovirale therapie in een patiënt gestaakt zou worden, de virusproductie terug te starten. Integratie vormt dus één van de belangrijkste barrières voor een eradicatie of genezing van een HIV-infectie.
HIV integratie wordt gecatalyseerd door het virale enzyme integrase in samenwerking met de cellulaire cofactor LEDGF/p75. LEDGF/p75 werd in het verleden in onze groep geïdentificeerd als een bindingspartner van HIV integrase en er werd aangetoond dat depletie van LEDGF/p75 in de cel (door middel van RNAi) HIV replicatie kon afremmen. Echter, replicatie was niet volledig geblokkeerd en dit werd toegeschreven aan de nog minieme hoeveelheid LEDGF/p75 die overbleef in de cel na depletie door middel van RNAi. Een latere studie, gebruik makende van PSIP1 (het gen coderend voor LEDGF/p75) knockout muizencellen toonde dat HIV-afgeleide vector-transductie in deze cellen eveneens onvolledig werd afgeremd. Verschillende vragen bleven echter (mede om methodologische redenen) onbeantwoord: 1) is LEDGF/p75 essentieel voor HIV replicatie in een humane context? 2) zo niet, hoe kan HIV repliceren in de afwezigheid van dit eiwit? 3) kan HIVzich aanpassen aan de afwezigheid van dit eiwit? en 4) blijven zogenaamde LEDGINs, moleculen die erop gericht zijn de interactie tussen LEDGF/p75 en integrase te doorbreken en die in parallel met deze studie in ontwikkeling waren in onze groep, actief in de afwezigheid van LEDGF/p75? Een antwoord op deze laatste vraag is van fundamenteel belang gezien de onvolledige onderdrukking van virus replicatie in de praktijk snel zal leiden tot het ontwikkelen van resistentie en het gebruik van medicatie, die op deze stap in de cyclus inwerkt, zou hypothekeren. In deze studie maakten we een humane somatische LEDGF/p75 knockout cellijn, wat ons in staat stelde in de volledige afwezigheid van LEDGF/p75 (in tegenstelling tot bijvoorbeeld RNAi-gemedieerde technieken) HIV replicatie te bestuderen.
In een eerste hoofdstuk beschrijven we het maken en valideren van deze cellijn. We tonen aan dat LEDGF/p75 knockout leidt tot een ernstigereductie van de virale replicatie maar dat nog beperkte replicatie van laboratorium virus-stammen mogelijk blijft. We tonen aan dat deze replicatie gemedieerd wordt door een eiwit dat structureel zeer gelijkend is op LEDGF/p75, namelijk HRP-2. Echter in aanwezigheid van LEDGF/p75 lijkt er geen rol weggelegd te zijn voor HRP-2 in de HIV replicatiecyclus. We tonen aan dat LEDGINs, actief blijven, zelfs in de afwezigheid van LEDGF/p75 en dat deze de interactie met zowel LEDGF/p75 als met HRP-2 blokkeren.
In een tweede hoofdstuk kijken we meer naar de rol van LEDGF/p75 in het bepalen van het integratie distributie patroon. In normale omstandigheden (zogenaamd wild type omstandigheden) zal HIV integratie voornamelijk in genen plaatsvinden. Wanneer we de hoeveelheid LEDGF/p75 in een cel verminderen, zien we dat het virus zich op andere plaatsen in het genoom zal nestelen. Het integratiepatroon verschuift naar een meer onwillekeurig patroon (random integratie), na onderdrukking van LEDGF/p75 expressie in de gastheercel. We zagen echter dat zelfs in afwezigheid van LEDGF/p75, dit patroon niet volledig random was. Wanneer we bovenop LEDGF/p75, ook nog eens HRP-2 expressie verminderen, zien ze een bijkomende shift van het integratiepatroon naar random. Hoewel dit voorlopig louter conceptuele informatie biedt, geeft dit een beter inzicht hoe HIV zijn integratieplaats selecteert en kan dit implicaties hebben voor latent geïnfecteerde cellen (cellen die HIV in zich dragen maar niet steeds herkendworden door het afweersysteem van het lichaam en vermoedelijk levenslange therapie noodzakelijk maken) of gentherapie waarbij gebruik gemaakt wordt van HIV-afgeleide vectoren en er een probleem van insertionele mutagenesis (als integratie een wijziging in gen-expressie en mogelijk kwaadaardige omvorming van de gastheercel teweegbrengt) kan plaatsvinden.
In het derde hoofdstuk gaan we na of LEDGF/p75 ook een functie heeft tijdens post-integratie stappen. Hoewel onverwacht, zien we ook hier een rol voor LEDGF/p75 weggelegd. Het exacte mechanisme wordt momenteel onderzocht en sluit aan bij onderzoek naar LEDGINs, welke zowel pre- alspost-integratiestappen blokkeren.
In een vierde hoofdstuk, gebruikenwe ons LEDGF/p75 knockout cel-model om LEDGF/p75-varianten te evalueren. Deze LEDGF/p75 mutaties werden geïndentificeerd bij zeldzame HIV patiënten, namelijk deze die geïnfecteerd zijn, maar zelfs zonder therapie niet evolueren naar AIDS (ook long-term non-progressors genaamd). Mogelijks speelt variatie in cellulaire eiwitten hierin een rol bijvoorbeeld door HIV replicatie minder goed te ondersteunen. Gebruik makend van verschillende technieken (virus replicatie, proteïne-proteïne interactie en computer-modeling) kunnen we de gevonden LEDGF/p75 mutanten niet linken methet klinisch verloop bij de patiënten waarin ze waren beschreven. Gezien de regio waarin deze mutanten voorkomen (in de buurt van het integrasebindend gedeelte van LEDGF/p75), noopt dit tot verder onderzoek naar een mogelijke indirecte invloed op de virale replicatie in deze patienten.
Tot slot, stelt onze aanpak ons in staat om fundamentele wetenschappelijke vragen te beantwoorden en zo nieuwe antivirale methoden te valideren en hun ontwikkeling naar klinische toepassingen te ondersteunen en rechtvaardigen. Echter, eveneens blijven verschillende vragen onopgelost,namelijk of HIV zich kan aanpassen aan de afwezigheid van LEDGF/p75? Hoewel deze vraag in principe onbeantwoord blijft, suggereert het feit dateen uitgebreid deel van mijn doctoraatswerk hieraan gewijd werd, echterzonder vaststelling van significante adaptatie, dat dit vermoedelijk een zeer moeilijk process is voor het virus. Verder, niet geheel onverwacht in wetenschappelijk onderzoek, ontstonden er nieuwe vragen: o.a. hoe inhibeert LEDGF/p75 post-integratie stappen of wat is de impact van een gewijzigde integratie opdat een latent virus zou kunnen gereactiveerd worden. Dit laatste sluit aan bij onderzoek dat tracht een eradicatie te zoeken voor HIV voor een individuele patiënt.
In deze thesis is ons vertrekpunt de HIV replicatiecyclus en zijn nauwe interactie met de gastheer. Door middel van fundamenteel wetenschappelijk onderzoek trachten we een beter inzicht te verkrijgen in de HIV replicatiecyclus om zo potentieel nieuwe doelwitten te identificeren en te valideren om finaal nieuwe (conventionele en/of minder conventionele) behandelingsstrategieën te ontwikkelen die complementair zijn aan de bestaande antiretrovirale middelen. In het bijzonder richten we onze aandacht in deze thesis op de rol vanhet cellulaire eiwit Lens epithelium-derived growth factor, kortweg LEDGF/p75, in de HIV replicatiecyclus. We relateren onze bevindingen met de ontwikkeling van LEDGINs, een nieuwe klasse van antiretrovirale medicatie gericht tegen de interactie tussen het virale integrase en LEDGF/p75, alsook met genetische varianten van LEDGF/p75 welke in patiënten werden geïdentificeerd om zo een brug te slaan tussen fundamenteel onderzoeken de klinische realiteit.
Integratie van het virale DNA in het genoom van de gastheer is een essentiële stap in de replicatie cyclus van het virus die ervoor zorgt dat de gastheercel voortaan de genetischeinformatie van het virus zal dragen en aanleiding kan geven tot de vorming van nieuwe viruspartikels. Het zorgt bovendien voor het ontstaan vaneen reservoir van cellen waarin HIV is gearchiveerd, die ontsnappen aanhet immuunsysteem en waar het mogelijk is voor het virus om, eens antiretrovirale therapie in een patiënt gestaakt zou worden, de virusproductie terug te starten. Integratie vormt dus één van de belangrijkste barrières voor een eradicatie of genezing van een HIV-infectie.
HIV integratie wordt gecatalyseerd door het virale enzyme integrase in samenwerking met de cellulaire cofactor LEDGF/p75. LEDGF/p75 werd in het verleden in onze groep geïdentificeerd als een bindingspartner van HIV integrase en er werd aangetoond dat depletie van LEDGF/p75 in de cel (door middel van RNAi) HIV replicatie kon afremmen. Echter, replicatie was niet volledig geblokkeerd en dit werd toegeschreven aan de nog minieme hoeveelheid LEDGF/p75 die overbleef in de cel na depletie door middel van RNAi. Een latere studie, gebruik makende van PSIP1 (het gen coderend voor LEDGF/p75) knockout muizencellen toonde dat HIV-afgeleide vector-transductie in deze cellen eveneens onvolledig werd afgeremd. Verschillende vragen bleven echter (mede om methodologische redenen) onbeantwoord: 1) is LEDGF/p75 essentieel voor HIV replicatie in een humane context? 2) zo niet, hoe kan HIV repliceren in de afwezigheid van dit eiwit? 3) kan HIVzich aanpassen aan de afwezigheid van dit eiwit? en 4) blijven zogenaamde LEDGINs, moleculen die erop gericht zijn de interactie tussen LEDGF/p75 en integrase te doorbreken en die in parallel met deze studie in ontwikkeling waren in onze groep, actief in de afwezigheid van LEDGF/p75? Een antwoord op deze laatste vraag is van fundamenteel belang gezien de onvolledige onderdrukking van virus replicatie in de praktijk snel zal leiden tot het ontwikkelen van resistentie en het gebruik van medicatie, die op deze stap in de cyclus inwerkt, zou hypothekeren. In deze studie maakten we een humane somatische LEDGF/p75 knockout cellijn, wat ons in staat stelde in de volledige afwezigheid van LEDGF/p75 (in tegenstelling tot bijvoorbeeld RNAi-gemedieerde technieken) HIV replicatie te bestuderen.
In een eerste hoofdstuk beschrijven we het maken en valideren van deze cellijn. We tonen aan dat LEDGF/p75 knockout leidt tot een ernstigereductie van de virale replicatie maar dat nog beperkte replicatie van laboratorium virus-stammen mogelijk blijft. We tonen aan dat deze replicatie gemedieerd wordt door een eiwit dat structureel zeer gelijkend is op LEDGF/p75, namelijk HRP-2. Echter in aanwezigheid van LEDGF/p75 lijkt er geen rol weggelegd te zijn voor HRP-2 in de HIV replicatiecyclus. We tonen aan dat LEDGINs, actief blijven, zelfs in de afwezigheid van LEDGF/p75 en dat deze de interactie met zowel LEDGF/p75 als met HRP-2 blokkeren.
In een tweede hoofdstuk kijken we meer naar de rol van LEDGF/p75 in het bepalen van het integratie distributie patroon. In normale omstandigheden (zogenaamd wild type omstandigheden) zal HIV integratie voornamelijk in genen plaatsvinden. Wanneer we de hoeveelheid LEDGF/p75 in een cel verminderen, zien we dat het virus zich op andere plaatsen in het genoom zal nestelen. Het integratiepatroon verschuift naar een meer onwillekeurig patroon (random integratie), na onderdrukking van LEDGF/p75 expressie in de gastheercel. We zagen echter dat zelfs in afwezigheid van LEDGF/p75, dit patroon niet volledig random was. Wanneer we bovenop LEDGF/p75, ook nog eens HRP-2 expressie verminderen, zien ze een bijkomende shift van het integratiepatroon naar random. Hoewel dit voorlopig louter conceptuele informatie biedt, geeft dit een beter inzicht hoe HIV zijn integratieplaats selecteert en kan dit implicaties hebben voor latent geïnfecteerde cellen (cellen die HIV in zich dragen maar niet steeds herkendworden door het afweersysteem van het lichaam en vermoedelijk levenslange therapie noodzakelijk maken) of gentherapie waarbij gebruik gemaakt wordt van HIV-afgeleide vectoren en er een probleem van insertionele mutagenesis (als integratie een wijziging in gen-expressie en mogelijk kwaadaardige omvorming van de gastheercel teweegbrengt) kan plaatsvinden.
In het derde hoofdstuk gaan we na of LEDGF/p75 ook een functie heeft tijdens post-integratie stappen. Hoewel onverwacht, zien we ook hier een rol voor LEDGF/p75 weggelegd. Het exacte mechanisme wordt momenteel onderzocht en sluit aan bij onderzoek naar LEDGINs, welke zowel pre- alspost-integratiestappen blokkeren.
In een vierde hoofdstuk, gebruikenwe ons LEDGF/p75 knockout cel-model om LEDGF/p75-varianten te evalueren. Deze LEDGF/p75 mutaties werden geïndentificeerd bij zeldzame HIV patiënten, namelijk deze die geïnfecteerd zijn, maar zelfs zonder therapie niet evolueren naar AIDS (ook long-term non-progressors genaamd). Mogelijks speelt variatie in cellulaire eiwitten hierin een rol bijvoorbeeld door HIV replicatie minder goed te ondersteunen. Gebruik makend van verschillende technieken (virus replicatie, proteïne-proteïne interactie en computer-modeling) kunnen we de gevonden LEDGF/p75 mutanten niet linken methet klinisch verloop bij de patiënten waarin ze waren beschreven. Gezien de regio waarin deze mutanten voorkomen (in de buurt van het integrasebindend gedeelte van LEDGF/p75), noopt dit tot verder onderzoek naar een mogelijke indirecte invloed op de virale replicatie in deze patienten.
Tot slot, stelt onze aanpak ons in staat om fundamentele wetenschappelijke vragen te beantwoorden en zo nieuwe antivirale methoden te valideren en hun ontwikkeling naar klinische toepassingen te ondersteunen en rechtvaardigen. Echter, eveneens blijven verschillende vragen onopgelost,namelijk of HIV zich kan aanpassen aan de afwezigheid van LEDGF/p75? Hoewel deze vraag in principe onbeantwoord blijft, suggereert het feit dateen uitgebreid deel van mijn doctoraatswerk hieraan gewijd werd, echterzonder vaststelling van significante adaptatie, dat dit vermoedelijk een zeer moeilijk process is voor het virus. Verder, niet geheel onverwacht in wetenschappelijk onderzoek, ontstonden er nieuwe vragen: o.a. hoe inhibeert LEDGF/p75 post-integratie stappen of wat is de impact van een gewijzigde integratie opdat een latent virus zou kunnen gereactiveerd worden. Dit laatste sluit aan bij onderzoek dat tracht een eradicatie te zoeken voor HIV voor een individuele patiënt.
Datum:1 okt 2008 → 7 dec 2012
Trefwoorden:Schumann, Flanders, Mahler, Song, Audiovisual Song, androgens, spermatogenesis, conditional knockout, micrarray, androgen receptor, Anti Stigma, Membrane protein, Protein import, Biogenesis, Peroxisome, Peroxisome biogenesis disorder, Peroxin, Protein-protein interaction, Posttranslational modification, Welfare, Demence, e-learning, peroxisome membrane biogenesis, peroxisome degradation, autophagy, multi-color in vivo pulse-chase labeling, AIDS, HIV
Disciplines:Immunologie, Microbiologie, Systeembiologie, Laboratoriumgeneeskunde
Project type:PhD project