Gerichte evolutie van bioactieve verbindingen: Azol(in)e-bevattende post-translationeel gemodificeerde peptiden

Thiazool / oxazool-gemodificeerde microcins (TOMM's) zijn een klasse van post-translationeel gemodificeerde peptiden, gevonden in Bacteria en Archaea, en hebben aangetoond een breed scala aan biologische activiteiten te hebben, inclusief antimicrobiële, anti-kanker en anti-malaria verbindingen. Hoewel veel TOMM's zijn geïsoleerd uit natuurlijke bronnen en sommige chemisch zijn gesynthetiseerd, blijft deze klasse peptideverbinding een onderbelichte potentiële bron voor nieuwe bioactieve moleculen: chemische synthese van polyazol (in) es is een uitdaging, terwijl in vivo synthese afhankelijk is van heteromere eiwitcomplexen die zijn niet uitgebreid gekarakteriseerd. Het doel van het onderzoeksproject is om het E. coli microcin B17-synthase tot stand te brengen als een platform voor ontdekking en productie van nieuwe microcinen met diverse functies. Om dit doel te bereiken, zal het doctoraatsproject zich richten op twee gebieden: karakterisering van het E. coli microcin B17-complex en de gerichte evolutie van nieuwe microcinen. De Pinheiro-groep heeft onlangs een in vivo-platform voor de heterologe expressie van E. coli-microcin B17-voorloper (McbA) en synthase tot stand gebracht, evenals een functioneel scherm op basis van de co-cultuur van microcineproducent en doelwitstammen. Het platform heeft een screeningcapaciteit tussen 103 ~ 105 varianten per test. In eerste instantie zal het project de functionele ruimte rond de B17-synthasesubeenheden onderzoeken, gericht op mutaties op voorspelde functionele residuen. De residuen zijn al geïdentificeerd door de Pinheiro-groep en mutaties zullen worden ingevoerd door Darwin Assembly. Synthetase-varianten worden gescreend op functie en gezuiverde synthetase-componenten geanalyseerd op stabiliteit en structuur. Het tweede deel van het project zal zich richten op de isolatie van nieuwe microcins uit een bibliotheek die de sequentiebuurt (zowel samenstelling als lengte) van het wildtype B17 bemonstert. Om de sequentieruimte efficiënt te verkennen, zullen bibliotheken worden samengesteld met behulp van InDel-assemblage (een recent ontwikkelde strategie van de Pinheiro-groep voor een efficiënte verkenning van de sequentieruimte over verschillende lengten.) De bibliotheek zal worden gescreend tegen een reeks potentiële doelorganismen (bijv. subtilis, M. luteus, P. putida, E. coli) en actieve varianten gekarakteriseerd voor gastheerbereik en potentie. Een ander onderdeel van dit deel van het project is de verdere optimalisatie van het InDel-montageplatform, het integreren ervan in geautomatiseerde vloeistofverwerkingsplatformen en het onderzoeken van manieren om de efficiëntie van de assemblagecyclus te verhogen.