< Terug naar vorige pagina

Project

Immunoassay ontwerp van een fiber optic biosensor voor medische en agro-food toepassingen

Biosensoren hebben een breed toepassingsgebied  variërend van de landbouwindustrie en voedselveiligheid tot medische diagnose en milieumonitoring, en krijgen steeds meer commerciële aandacht. De steeds toenemende kosten in de gezondheidszorg stimuleren bovendien het onderzoek naar biosensoren die snelle, gevoelige, nauwkeurige en robuuste detectie ter plaatse mogelijk maken. Eén enkele biosensor die aan al deze vereisten voldoet, is echter nog niet op de markt verkrijgbaar.

Surface plasmon resonance (SPR) gebaseerde optische biosensoren vormen een veelbelovende technologie voor meerdere biosensor-gerelateerde toepassingen. Deze sensoren maken gebruik van plasmonische oppervlaktegolven om lokale veranderingen in brekingsindex te meten als gevolg van interacties tussen doelmoleculen en biomoleculen die op het sensoroppervlak zijn geïmmobiliseerd. De meest gebruikte SPR biosensor, gecommercialiseerd door Biacore, maakt gebruik van een prisma voor SPR-excitatie en verschaft zowel gevoelige als betrouwbare resultaten. Het apparaat is echter omvangrijk en duur en daarom niet geschikt voor detectie ter plaatse. Een beloftevol alternatief voor SPR-excitatie is het gebruik van optische vezels, met als voordeel dat deze betaalbaar en klein zijn. In dit proefschrift wordt een optische vezel SPR (FO-SPR) biosensor onderzocht voor een verscheidenheid aan toepassingen. De FO-SPR-biosensor is volledig geautomatiseerd, eenvoudig te miniaturiseren, betaalbaar en betrouwbaar. Hoewel dit principe reeds aangetoond  werd voor antilichaam- en DNA-gebaseerde bioassays, werd het tot nu toe nooit in echte biologische stalen geïmplementeerd.

Dit werk heeft tot doel om het potentieel van de FO-SPR biosensor te onderzoeken voor gevoelige en snelle detectie van  doelmoleculen in reële matrices met behulp van immunoassays. Om dit te bereiken werden twee doelmoleculen geselecteerd op basis van hun grootte en toepassingen, namelijk progesteron (een klein molecule dat relevant is voor de landbouwindustrie) en infliximab (een antilichaam dat relevant is voor de gezondheidszorgsector).

In de landbouwsector zijn maximale opbrengsten cruciaal om boeren in staat te stellen competitief te blijven. Voor melkproductie is het meer bepaald van cruciaal belang om tochtigheid bij koeien te detecteren, zodat kunstmatige inseminatie toegepast kan worden om zo het percentage aan geslaagde zwangerschappen te optimaliseren. Tochtigheid wordt vaak gedetecteerd door het progesteron-niveau in de melk te monitoren. Conventioneel wordt hiervoor ELISA gebruikt, maar dit vereist analyse van de stalen in een centraal laboratorium en het duurt bovendien enkele uren om de resultaten te verkrijgen. Onlangs werd een laterale flow-immunoassay (LFIA) op de markt gebracht, waarmee analyse op het bedrijf mogelijk wordt gemaakt in 15 minuten. Dit assay is echter minder gevoelig dan de commercieel beschikbare ELISA (cELISA). Om dit probleem op te lossen, werd een competitief immunoassay ontwikkeld met behulp van de FO-SPR-biosensor voor het bepalen van het progesteronniveau in melk. Een detectielimiet (LOD) van 0,5 ng/ml (1,6 nM) werd bereikt in melk-standaarden. Bovendien werd validatie van de test uitgevoerd in 6 stalen koemelk en vergeleken met de referentie cELISA, waarbij een goede correlatie werd verkregen (Pearson correlatie = 0.98, ICC = 0,97). Dit werk toont aan dat de FO-SPR-biosensor in staat is om binnen 20 minuten kleine moleculen in nanomolaire concentraties te detecteren in een complexe melkmatrix.

In de zorgsector kunnen patiënten baat hebben bij technieken voor continue opvolging van chronische aandoeningen en vroegtijdige diagnose van ziekten. Infliximab (IFX) is een therapeutisch antilichaam dat wordt toegediend aan patiënten met inflammatoire darmaandoeningen. Dit biologische middel vereist therapeutische monitoring om aanpassingen van de dosering mogelijk te maken en derhalve de uitkomst van de behandeling te optimaliseren. De traditionele methoden voor detectie van IFX, zoals ELISA en radio-immunoassay worden echter in een centraal laboratorium uitgevoerd, wat onmiddellijke aanpassingen van de toegediende dosis onmogelijk maakt. Voor deze toepassing werd een sandwich-immunoassay ontwikkeld. Een LOD van 2,2 ng/ml (15 pM) werd bereikt in 100-voudig verdund serum, in een totale tijd van 40 minuten. Het immunoassay werd gevalideerd met 5 serum-stalen van patiënten met inflammatoire darmziekte (IBD) die met IFX behandeld werden. Deze resultaten toonden een uitstekende overeenkomst tussen de FO-SPR en de klinisch gevalideerde ELISA (Pearson-correlatie van 0,998 en ICC van 0,983 met een inter-CV van minder dan 10%).

Aangezien detectie van IFX meestal uitgevoerd wordt in serum- of plasmastalen, moet hiervoor het bloedstaal van de patiënt bewerkt worden, hetgeen de doorlooptijd verlengt. Deze staalvoorbereiding kan echter vermeden worden door de directe detectie van IFX in volbloed. Bovendien kunnen patiënten via de gedroogde bloedspot (DBS) methode thuis bloed verzamelen en dus bezoeken aan het ziekenhuis vermijden. Een geavanceerd immunoassay werd ontwikkeld met een totale detectietijd van 10 minuten. Dit snelle immunoassay werd getest in matrices waaronder serum, plasma, volbloed en DBS. Een LOD van 0,9 ng/ml (5 pM) werd bereikt in 10-voudig verdund volbloed en een LOD van minder dan 2 ng/ml (10 pM) werd verkregen in 100-voudig verdunde matrices die hierboven werden vermeld. De kalibratiecurven voor deze 100-voudige verdunning gaven bovendien aan dat het matrixeffect voor deze verdunningsfactor niet significant was. Bovendien werden alle kalibratiecurven op een willekeurige manier en op twee onafhankelijke dagen uitgevoerd, met twee batches onafhankelijk voorbereide FO-SPR-sensoren en gouden nanopartikels (AuNP's). De statistische resultaten toonden aan dat er geen significant verschil was tussen de resultaten die op de twee verschillende dagen werden gegenereerd, wat een nieuwe kalibratie voor elke nieuwe batch FO-SPR-sensoren en AuNP’s overbodig maakt. Ten slotte werd een validatie van het immunoassay uitgevoerd met behulp van 10 klinische stalen van IFX-behandelde IBD-patiënten. Vergelijking van de resultaten van de FO-SPR sensor met de klinisch gevalideerde ELISA gaf een uitstekende overeenstemming tussen de twee systemen aan.

Dit proefschrift demonstreert het potentieel van de FO-SPR biosensor voor een verscheidenheid aan toepassingen die specifieke, gevoelige, snelle en robuuste detectie vereisen met een betaalbaar en draagbaar apparaat, zowel voor POC-diagnostiek als metingen ter plaatse.

Datum:1 okt 2012 →  3 okt 2018
Trefwoorden:Fiber optic biosensor, medical application, agro-food application
Disciplines:Andere chemie, Voeding en dieetkunde, Productie van landbouwdieren, Levensmiddelenwetenschappen en (bio)technologie, Landbouw, land- en landbouwbedrijfsbeheer, Biotechnologie voor landbouw, bosbouw, visserij en aanverwante wetenschappen, Visserij, Analytische chemie, Macromoleculaire en materiaalchemie
Project type:PhD project