Isolatie, productie, semi-kristallijne aggregatie en potentiële farmaceutische toepassing van amylose

Amylose (AM) is een quasi lineair glucosepolymeer. Samen met amylopectine (AP) vormt het de basis van granulair zetmeel. Het gehalte AM in natieve zetmelen varieert van 20 tot 35%. Het beïnvloedt sterk de functionaliteit van zetmeel in waterige systemen. In dispersies van volledig verstijfseld zetmeel speelt AM-kristallisatie een belangrijke rol in het verstijfselingsproces. In veel levensmiddelenbereidingen begint de AM-netwerkvorming onmiddellijk na de zetmeelverstijfseling. Door aggregatie van AM worden aaneengesloten cilindrische objecten en uiteindelijk fractale structuren gevormd. Deze structurele overgangen worden gebruikt om textuur te geven aan verschillende voedingsproducten. AM-kristallisatie wordt ook gebruikt om type III enzym-weerstandig zetmeel (RS) te produceren, een soort zetmeel dat niet volledig wordt verteerd (en dus gedeeltelijk bestand is tegen vertering), in de dikke darm gefermenteerd kan worden en dat verschillende potentiële gezondheidsvoordelen heeft.

AM kristallisatie hangt af van factoren zoals de gemiddelde polymerisatiegraad (DP), de concentratie ervan in de suspensie, de temperatuur en de tijd. De concentratie ervan bepaalt het type van kristalstructuur dat het aanneemt. Terwijl in verdunde waterige systemen [typisch <10,0% (w/v)] AM zich ordent onder de vorm van lamellaire plaatjes, worden sferulitische kristalstructuren waargenomen in geconcentreerde suspensies [typisch > 10,0% (w/v)]. Deze kristalstructuren zijn bestand tegen spijsvertering door pancreas α-amylase. Ze kunnen echter gefermenteerd worden door de micro-organismen in de menselijke dikke darm.

Ondanks de relevantie van AM als een standalone polymeer, zijn de onderliggende mechanismen van de aggregatie ervan hoofdzakelijk onderzocht in zetmeelsystemen, die van nature ook AP bevatten. Tegen deze achtergrond was het doel van dit proefschrift om meer inzicht te verwerven in de productie of isolatie van AM en de fysico-chemische eigenschappen ervan, om zo een basis te bieden voor het gebruiken van AM-kristalliniteit bij de ontwikkeling van mogelijke toepassingen binnen en buiten de voedingsindustrie.

Een methode voor het produceren van zuivere AM op laboratoriumschaal was nodig om de mechanismen van AM aggregatie te bestuderen. Daarom richt het eerste deel van dit proefschrift zich op het produceren of isoleren van AM. Drie meest toegepaste in vitro benaderingen werden overwogen voor het verkrijgen van AM: enzymatische synthese, AM-uitloging en AM-complexatie na zetmeeldispersie. De productie of isolatie van AM is echter niet eenvoudig. De eigenschappen (d.w.z. zuiverheid, gemiddelde DP en polydispersiteit) van geïsoleerde AM worden beïnvloed door de experimentele condities bij elke methodologie. Uitloging met behulp van water maakt het mogelijk om op grote schaal AM te isoleren en omvat het verhitten van een zetmeelsuspensie boven de verstijfselings-temperatuur van zetmeel. Verschillende factoren beïnvloeden uitloging van AM, inclusief de uitlogingstemperatuur (LT) en zetmeelconcentratie. Een respons-oppervlak analyse met een face centered central composite design werd geïmplementeerd om het effect van zetmeelconcentratie [3,0-7,0%  (w/v) van maïs (Zea mays L.)] en LT (70-90 ˚C) op waterige uitloging van AM te bestuderen, als een manier om de condities te optimaliseren voor het verkrijgen van de hoogste opbrengst van lange keten AM [gemiddelde DP (DPn) variërend van 860 tot 930] en de hoogste zuiverheid. Tweede-orde empirische modellen werden aangepast via de kleinst kwadratische benadering. Verwaarloosbare termen werden verwijderd met behulp van terugmodelreductie. Verwaarloosbare lack of fit terms werden verkregen voor de responsen van totaal uitgeloogd koolhydraat en DPn. De optimalisatie werd vervolledigd met een wenselijkheidstest waarbij gebruik werd gemaakt van de zuiverheid van de extracten. Als optimaliseringsdoelstellingen werden de maximale uitlogingsopbrengsten DPn ≈ 900 en zuiverheid> 95 % vastgesteld. Er werden zogenaamde contour plots en voorspellingsprofilers verkregen die door anderen gebruikt kunnen worden voor op maat gemaakte productie van uitlogingsproducten. LT had het meest significante effect vermits opbrengsten en DPn verhoogden met temperatuur ten koste van de zuiverheid. Zuiverheid kwam sterk in het gedrang bij behandelingen bij temperaturen hoger dan 85 ˚C. Dit werd weerspiegeld in de hoge DPn waarden (> 1.500) die op de aanwezigheid van AP materiaal duidden. Het gebruik van 3,0% (w/v) maïszetmeelsuspensie bij een LT van 81 °C resulteerde in de grootste opbrengst (15,0%, zetmeelbasis) van hoge DPn AM-ketens (DPn ≈ 900), met minder dan 3,3% van niet-AM materiaal.

Het effect van zetmeelkristalliniteit op de waterige uitloging van AM werd ook bestudeerd. De stabiliteit van zetmeelkristallen werd veranderd via tempering (annealing). Uitloging werd onderzocht in een temperatuurbereik van 60-90 °C. De opbrengst van uitlogingsproduct (leachate), gemiddelde DP en zuiverheid waren gerelateerd aan de smeltingsgraad van de zetmeelkristallen bij de LT zoals bepaald via differentiële scanning calorimetrie (DSC). Tempering verhoogde de AP kristalstabiliteit en hierdoor ook de resterende kristalliniteit bij een gegeven LT. Verwaarloosbare AM-uitloging vond plaats bij temperaturen lager dan deze van de tempering-afhankelijke begintemperatuur van smelten. Uitloging kon dus profiteren van gedeeltelijk smelten. Soortgelijke AM-uitlogingsproducten werden verkregen wanneer de mate van zetmeelsmelting lager was dan 80 %. Verlies van meer dan 95 % van de smeltingsentalpie resulteerde in een hogere gemiddelde DP van de uitlogingsproducten ten koste van de zuiverheid. Aangezien de kristalliniteit van getemperd zetmeel bij een gegeven LT hoger was dan die van natief zetmeel, was de zuiverheid van uitlogingsproducten verkregen uit dergelijke zetmelen hoger. Ondanks het feit dat er geen residuele AP-kristallen meer aanwezig waren bij 90 °C, vertoonde getemperd zetmeel onderworpen aan uitloging bij deze temperatuur nog steeds AM-extracten in hogere opbrengsten en met een hogere zuiverheid dan natief zetmeel. De meer efficiënte uitloging in dit geval kan het gevolg zijn van tempering-geïnduceerde versterkte AP-AP interacties en AM-ontknoping van AP.

Het tweede deel van dit werk was gericht op de semi-kristallijne aggregatie van AM. Terwijl eerdere studies de rol van de gemiddelde AM DP op de aggregatie ervan in verdunde waterige systemen hebben toegelicht, zijn er geen studies uitgewerkt over de kristallisatie van AM in geconcentreerde systemen. Hier werden AM-stalen met verschillende gewichtsgemiddelde DP’s (DPw) geproduceerd en onderworpen aan een verwarming-koeling-verwarmingsproces. Aangezien AM kristallen alleen smelten bij temperaturen hoger dan 100 °C, werden hogedruktoestellen gebruikt om de gehydrateerde stalen te analyseren. Waterige AM dispersies [25,0% (w/v)] met een hoge (DPw = 830), gemiddelde (DPw = 340) en lage (DPw = 60) DP werden eerst verwarmd tot 180 °C om volledig opgeloste waterige oplossingen van AM te produceren. Tijdens daaropvolgende afkoeling tot omgevingstemperatuur gevolgd door heropwarming tot 180 °C, werden hun thermische en structurele veranderingen door middel van DSC en röntgendiffractie bij kleine (SAXS) en brede (WAXD) hoek onderzocht. Tijdens afkoelen werden sferulitische kristalaggregaten gevormd waarvan de afmetingen daalden in de volgorde gemiddelde DP> lage DP> hoge DP AM. De kristallisatie was ook afhankelijk van de AM DP. Gemiddelde DP AM kristallen werden gevormd bij hoge temperaturen en de exotherme overgang ervan vertoonde een piek bij 74 ˚C. Lage en hoge DP AM kristallen werden bij temperaturen lager dan 60 °C gevormd met pieken van respectievelijk 37 en 42 °C. Een tweede (kleine) fractie was zichtbaar bij lage DP AM en verscheen dicht bij de geobserveerde hogetemperatuurtransitie voor midden DP. Gedurende de daaropvolgende verwarming waren de gemiddelde DP AM kristallen het meeste stabiel en hun smeltingssignaal bereikte een piek bij 156 °C. Lage DP AM kristallen smeltten in twee brede temperatuurbereiken met pieken bij 104 °C (grote fractie) en 150 °C (kleine fractie). Kristallen van hoge DP AM smolten in een gelijkaardig bereik als geobserveerd voor laag DP AM.

Tijd-temperatuur geresolveerde SAXS- en WAXD-metingen werden voor het eerst toegepast om de nanostructurele overgangen te onthullen van AM tijdens de vorming en het verdwijnen van semikristallijne sferulieten van lage en gemiddelde DP AM. WAXD metingen toonden naast amorf materiaal de vorming van B-type AM polymorfen aan, ongeacht de temperatuur. Veranderingen in de kristalliniteitsindex verschenen in de temperatuurbereiken waar DSC exo of endothermisch overgangen toonde. Inter-kristalliet-interferentie werd gevonden in SAXS voor lage DP AM, terwijl dit niet het geval was voor gemiddelde DP AM. Gemiddelde DP AM sferulieten werden geclassificeerd als open (geen interferentie), die van lage DP AM als compact (met interferentie). Open sferulieten hadden een lagere interne kristalliniteit (minder dan 20 %) dan de compacte (tot 80 %), maar konden de ruimte volledig innemen bij afkoeling. Open sferulieten van gemiddelde DP AM starten vanaf de kristallisatie van AM in een homogene vloeibare fase. Dit vormt AM-depletiezones rond de kristallen bij een hoge kristallisatiesnelheid. Bij lagere temperatuur groeien sferulieten en worden nieuwe sferulieten gecreëerd aan lagere snelheid. Hier kan de vloeibare fase de tred volgen en tegelijkertijd homogeniseren. In het geval van sferulieten afkomstig van lage DP AM, worden bij hoge temperaturen eerst open sferulieten gevormd, vergelijkbaar met sferulieten van gemiddelde DP AM. Bij verdere afkoeling scheidt het systeem zich in AM-rijke en -arme vloeibare fasen. Sferulieten migreren naar de AM-rijke regio en verdere AM kristallisatie treedt snel op, wat de aggregaten omvormt tot compacte sferulieten. Voor hoge DP AM werd gesuggereerd dat verstrikking van de ketens de vorming van grote en geordende aggregaten bij hoge temperaturen afremt. In plaats daarvan wordt vloeistof-vloeistoffasenscheiding begunstigd, en de kristallisatie van AM in kleine, ongeordende sferulieten vindt plaats in de AM-rijke zone.

In een derde en laatste deel werd de kristalliniteit van AM gebruikt in de ontwikkeling van een mogelijke farmaceutische toepassing. Type III RS uit onttakte cassave (Manihot esculenta Crantz) zetmeel werd geproduceerd door AM kristallisatie te promoten in een hydrothermale behandeling. Een thermostabiele kristalfractie werd gevormd. Type III RS kristalsmelting werd inderdaad alleen waargenomen bij temperaturen hoger dan 120 °C. RS gehaltes gemeten tijdens in vitro vertering stegen van 36,6 (in het startmateriaal) tot 95,1% (in het finale type III RS product). RS-gehaltes waren positief gecorreleerd met de mate van kristalliniteit. Type III RS was zeer in vitro fermenteerbaar door menselijke fecale micro-organismen en resulteerde in een significante productie van korte-keten vetzuren. Acetaatgehaltes waren veel hoger dan die van propionaat en butyraat in vergelijking met hun gehaltes geobserveerd bij een fecale blanco. Een granulaat van type III RS [60-70 % (w/w)] en ethylcellulose [40-30 % (w/w)] werd gebruikt om tabletten van 5-aminosalicylzuur (5-ASA) te coaten door gebruik van een compressie-coating aanpak. Het coaten beschermde 5-ASA tijdens zijn transit door een maagdarmkanaal model. Er werd geen vrijgave waargenomen in gastrisch medium en verwaarloosbare vrijgave werd waargenomen na 2 uur in darmmedium dat pancreas amylase bevatte. Het gebruik van dit materiaal kan interessanter zijn dan dat van polymeren zoals cellulose doordat een (mogelijk) therapeutisch effect uitgeoefend wordt door verhoogde korte-keten vetzuurgehaltes als gevolg van fermentatie. Deze studie leverde aldus ook de basis voor toepassingen van AM-kristallen in de farmaceutische industrie.