In kaart brengen van skeletale progenitoren in embryonaal kraakbeen van de ledematen: toepassing in botweefselengineering

Grote botdefecten kunnen worden veroorzaakt door zware trauma's, infecties, prothetische revisie, bottumorresectie of niet-genezende fracturen en in de klinische praktijk blijft hun genezing een therapeutische uitdaging. Huidige behandelingen zoals autotransplantaten vanuit de bekkenkam of allotransplantaten geoogst van kadavers vereisen meervoudige en repetitieve ingrepen en zijn verbonden aan verschillende risico's, wat resulteert in een hoge socio-economische belasting op de maatschappij. Er zijn verschillende strategieën voor weefselmanipulatie ontwikkeld om deze uitdagingen het hoofd te bieden en één daarvan is gebaseerd op botontwikkelingstechnieken. Deze benadering omvat de in vitro productie van een levend kraakbeenconstruct dat bij de implantatie bot vormt volgens het process van endochondrale ossificatie, gelijkaardig zoals tijdens de embryonale ontwikkeling.

Tijdens dat proces, Prrx1-positieve mesenchymale cellen condenseren in ontwikkelende ledematen en differentiëren in Sox9+ chondrocyten. Deze chondrocyten prolifereren, organiseren zich in kolommen en ondergaan hypertrofie onder controle van de Ihh/PTHrP feedback loop. Na celmaturatie tot Runx2+ hypertrofe chondrocyten treedt een verschuiving op in de matrixsynthese van collageen type II naar type X. Deze matrix verkalkt en wordt vervangen door bot door binnendringende osteoblasten en transdifferentiërende niet-apoptotische, hypertrofe chondrocyten, die beide worden gekarakteriseerd door de expressie van de transcriptiefactor Osterix en secretie van osteoïde matrix.

De celbronnen om intermediaire kraakbeenconstructen voor botgenezing te ontwikkelen zijn divers, waarbij het periosteum momenteel als een uitstekende bron wordt beschouwd. Celtraceer experimenten tijdens botgenezing in muizen hebben aangetoond dat tijdens het botherstel osteoblasten en osteoclasten afkomstig zijn uit het beenmerg, endosteum en periosteum, maar dat de chondrocyten van de callus voornamelijk afkomstig zijn van het periosteum. Meer recentelijk is aangetoond dat menselijke periostale cellen in vitro kunnen worden geprimed, door gebruik te maken van geconditioneerd medium en celaggregatie, tot een kraakbenig tussenweefsel dat zich ectopisch kan ontwikkelen tot bot en de genezing van een orthotoop lang botdefect kan faciliteren. Deze cellen genereerden echter nog steeds overmatig littekenweefsel. Verrijking voor osteochondrogene precursoren zal naar verwachting resulteren in een verhoogd botvormend vermogen en een verbeterde zuiverheid van het celtherapeutisch product.

Verschillende studies bij muizen richtten zich op de identificatie en bijdrage van skeletale stamcellen en osteochondrogene precursoren in de botontwikkeling, homeostase en fractuurgenezing. Deze cellen bevonden zich ofwel in de zone onder de groeiplaat, de bloedvatniche of het periosteum. Verschillende moleculaire merkers zijn geassocieerd met deze cellen zoals Nestin, Gremlin1, Leptine Receptor, Gli1 en Periostin. In een andere studie vertoonden "regenboog" volwassen muizen een hoge frequentie van klonale gebieden in de groeiplaat, gekenmerkt door Alpha V Integrin (CD51) expressie, maar negatief voor CD45 en TER119. Deze populatie werd vervolgens opgesplitst in acht subpopulaties op basis van differentiële expressie van CD105, CD90.2, CD200 en 6C3 celoppervlakte merkers. Door deze strategie te combineren met in vivo en in vitro technieken, brachten ze de ontwikkeling van bot, kraakbeen en stromaal weefsels van een postnatale muis skeletale stamcel en zijn downstream progenitoren in kaart, in een hiërarchisch programma vergelijkbaar met hematopoëse.

In dit proefschrift hebben we de hypothese geformuleerd dat verrijking voor de juiste skeletale precursoren leidt tot een verhoogde botvorming en de mogelijkheid om de celdosering te verlagen zonder het potentieel van het celgebaseerde construct te verliezen. Om deze hypothese te testen hebben we de prospectieve isolatie van stam- en progenitorcelpopulaties van het ledemaat kraakbeen van het muizenembryo 14,5 dpc geoptimaliseerd.

We toonden aan dat primaire muis embryonale kraakbeencellen hun ontwikkelingsprogramma voortzetten en een botorganoïde vormden in een in vivo ectopisch botvormende assay, wanneer ingekapseld in collageen I hydrogel. Celtraceer experimenten met eGFP+ embryonale kraakbeencellen toonden de bijdrage van donorcellen aan het botweefsel. Om de precursoren te zuiveren uit het embryonaal kraakbeen, ontwierpen we een polychromatisch flow cytometrie protocol, gebaseerd op de eerder beschreven merkers indicatief voor skeletale stamcellen. We hebben uit de embryonale kraakbeencellen twee celpopulaties gezuiverd, namelijk de muis skeletale stamcel en een pre-progenitor, een directe afgeleide van de mSSC. Beide populaties waren in staat om bot te vormen in de collageen I hydrogel, en kwantificering van het botvolume gaf meer gevormd weefsel in vergelijking met de complete pool van embryonale kraakbeencellen, zelfs bij lagere celdichtheid. Bovendien werd het waargenomen botweefsel voornamelijk gevormd door endochondrale ossificatie, aangezien na een week in vivo hypertroof kraakbeen werd waargenomen. We merkten echter op dat het potentieel van de precursoren sterk beïnvloed werd door de hydrogel die de cellen inkapselt, aangezien een significante vermindering van de botvorming werd waargenomen toen de cellen werden geimplanteerd in alginaat hydrogel.

Vervolgens wilden we de mogelijkheid onderzoeken om de primaire embryonale kraakbeencellen te expanderen in vitro, en tegelijkertijd proberen om de precursoren te verrijken tijdens deze expansiefase. Hiervoor hebben we de embryonale kraakbeencellen gekweekt in aanwezigheid van FGF2, een standaard ligand dat gebruikt wordt in stamcel-expansie protocollen. Genexpressie analyse toonde geen dedifferentiatie van FGF2 geëxpandeerde cellen aan in vergelijking met cellen geëxpandeerd in standaard groeimedium met serum, bepaald door de expressie van ACTA2. Flow cytometrische analyse van de celmembraan merkers toonde een verrijking aan voor stamcellen en progenitors na twee passages. Echter, toen de stamcellen en precursoren van geëxpandeerde cellen werden geïmplanteerd in collageen I, werd een groot verlies aan in vivo botvorming waargenomen. De opgehaalde explanten waren 50% kleiner, het volume van het botweefsel was verminderd en deze bevatten litteken weefsel.

In dit proefschrift toonden we aan dat zuivering van cel precursoren een gunstig effect had op het weefsel dat gevormd werd bij in vivo implantatie en dat het mogelijk was de celdosering te verminderen zonder de in vivo botvormende potentie negatief te beïnvloeden. Echter, prospectieve in vivo validatie van celmembraan merkers die skeletale precursoren identificeren is vereist, kan afhankelijk zijn van de celbron, en het verband tussen in vitro celidentiteit en in vivo differentiatiepotentieel kan veranderen door in vitro manipulaties