Natuurlijke en experimentele evolutie als een nieuwe aanpak om genetische mechanismen te identificeren die aan de basis liggen van het complexe multidrug tolerante fenotype.

Tijdens het gouden tijdperk van antibioticumontwikkeling leek het alsof bacteriële infecties voorgoed waren teruggedrongen. De medische wereld is inderdaad radicaal veranderd door antibiotica: voorheen ongeneeslijke infectieziekten werden genezen en infecties konden worden voorkomen. Antibioticagebruik wordt tegenwoordig echter belemmerd door resistentie-ontwikkeling. Wat het probleem nog erger maakt, is dat vele bacteriën een antibioticumbehandeling niet alleen kunnen overleven door het verwerven van genetische, resistentie-verlenende mutaties, maar ook door 'bacteriële persistentie'. In een antibioticumgevoelige bacteriële populatie differentiëren sommige cellen namelijk tot antibioticumtolerante 'persistors'. De opoffering van een deel van de populatie ter vorming van tolerante maar dormante varianten, is een vorm van risicospreiding. Persistors verhinderen een efficiënte behandeling door te zorgen voor een heropflakkering van de infectie en door het bespoedigen van resistentie-ontwikkeling. 

Ondanks het klinische belang van persistentie, zijn er bijna geen experimentele data voorhanden die persistentie-evolutie beschrijven onder antibioticumblootstelling. We gingen daarom hypotheses na die geformuleerd werden door risicospreidingstheorieën. De mate waarin er geinvesteerd wordt in deze dormante levensvormen zou namelijk evolueren om omgekeerd te correleren met de lengte van risicoloze condities. Door middel van in vitro evolutie-experimenten met afwisselende antibioticumbehandelingen toonden we aan dat een dagelijkse behandeling met aminoglycosiden zeer snel selecteert voor mutanten met extreem hoge persistorniveaus, tot 100%, en dit zowel in een labostam als in een pathogene Escherichia coli variant. De toegenomen antibioticumtolerantie zorgt ook voor een betere bescherming tegen een antibioticum met een ander werkingsmechanisme, een vorm van kruis-tolerantie die kenmerkend is voor het persistentiefenotype. 

Vervolgens gingen we de voor- en nadelen na van het hoge persistentiefenotype. De extreme voordelen van de toegenomen tolerantie tijdens dagelijkse antibioticumbehandelingen zijn niet enkel het gevolg van de hogere persistorniveaus maar ook van het beter reageren op omgevingsstimuli, e.g. het sneller hernemen van groei na antibioticumbehandeling en de daaropvolgende verdunning in vers, antibioticum-vrij medium. Hoewel de mutanten met hoog persistorniveau een kost vertonen in antibioticumafwezigheid, beperken ze deze kost door het tijdstip waarop persistors gevormd worden bij het bereiken van stationaire fase, te verlaten. De kost blijkt echter voldoende om evolutie (gedeeltelijk) terug te spoelen tot lagere persistorniveaus wanneer de sterk tolerante mutanten geëvolueerd werden in afwezigheid van het antibioticum. Een eigen persistentie-evolutie model voorspelt een inverse correlatie tussen het persistentieniveau en de lengte van de periode zonder antibioticum, net zoals meer algemene risicospreidings- en persistentiemodellen reeds deden. Dit verband werd aangetoond in evolutie-experimenten waarbij de behandelingsfrequentie gevarieerd werd en waardoor intermediaire persistorniveaus bekomen werden.

Stressresponsen en toxine-antitoxine modules werden reeds in verband gebracht met de vorming van persistors waarvan de tolerantie toegeschreven wordt aan een ofwel algemene dormantie, inactiviteit van specifieke doelwitten of verminderde antibioticumopname. Persistentiemechanismen zijn echter nog onduidelijk. De toegenomen tolerantie in dit werk werd veroorzaakt door enkelvoudige mutaties die vijf nieuwe persistentiegenen veranderden zonder deze uit te schakelen: oppB, nuoN, gadC, mscL and yaaU. Allemaal coderen ze voor transporters of kanalen in de membraan. We sloten echter uit dat een verlaagde antibioticumopname door een verlaging van de membraanpotentiaal de oorzaak is van de toegenomen tolerantie. Sommige van de mutanten hebben een verlaagde intracellulaire pH en ATP:ADP ratios, evenals een verlaagde de translatie-activiteit. Dit verklaart de toegenomen tolerantie echter niet in alle mutanten. De mutanten verschillen ook op regulatorisch niveau. De meeste onder hen hangen voor hun stationaire fasespecifieke toegenomen persistorniveau cruciaal af van de sigma factor RpoS en de stringente respons. Deze regulators spelen echter geen rol in de nuoN mutant terwijl de yaaU mutant zelfs een verhoogd tolerantieniveau in exponentiële phase heeft. De hoge persistorniveaus, waarvoor op identieke wijze geselecteerd werd, worden daarom mogelijks door verschillende mechanismen bepaald. 

Dit werk zorgt voor een beter begrip omtrent de evolutie van persistentie en zijn onderliggende mechanismen en zal uiteindelijk leiden tot een betere behandeling van bacteriële infecties. Naast de impact op het persistentieonderzoek, zullen onze bevindingen ook het onderzoek naar antibioticumresistentieontwikkeling en risicospreidingsstrategieën beïnvloeden.