"-omics" technologieën kan bijdragen tot het bestrijden van leeftijdsafhankelijke niet-overdraagbare aandoeningen in bevolkingen in epidemiologische transitie.

Samenvatting

Achtergrond en doelstellingen

De doelstelling van deze doctoraatsverhandeling was te onderzoeken of toepassing van “‑omics” technologieën kan bijdragen tot het bestrijden van leeftijdsafhankelijke niet-overdraagbare aandoeningen in bevolkingen in epidemiologische transitie. We kozen diastolische linkerkamerdisfunctie, hartfalen en chronisch nierlijden als ziektemodellen, omwille van hun hoge prevalentie in de bevolking, de wereldwijde toename in hun incidentie, zoals onder meer geraamd in de “Global Burden of Disease” rapporten van de Wereldgezondheidsorganisatie, en omwille van de niet beantwoorde behoeften van miljoenen mensen in een asymptomatisch ziektestadium voor wie betrouwbare niet-invasieve biomerkers een verschil kunnen uitmaken tussen gezond ouder worden en een verkorte levensverwachting met een lage levenskwaliteit.

Methoden

Tenzij anders gespecifieerd, deden we ons onderzoek in de “Flemish Study on Environment, Genes and Health Outcomes” (FLEMENGHO). Deze cohorte vertegenwoordigt een aselecte steekproef van families die wonen in een geografisch afgelijnd gebied in Noord Limburg, België. Gegevens verwerkt in deze doctoraatsverhandeling werden verzameld in 2005–2010 (basislijn) en in 2009–2013 (opvolging). We maten diastolisch linkerkamerfunctie echocardiografisch. We beschouwden een hogere topsnelheid van de mitralisklepring (e’) en een lagere verhouding van de topsnelheden van de bloedstroom doorheen de mitralisklep tot de beweging van de mitralisklepring (E/e’) in de vroege diastole als tekens voor een meer performante diastolische linkerkamerfunctie. In categorische analysen definieerden we diastolisch linkerkamerdisfunctie gebaseerd op leeftijdsspecifieke criteria voor vertraagde linkerkamerrelaxatie, verhoogde linkerkamervullingsdruk of beiden. Glomerulaire filtratie schatten we op basis van de serumcreatinineconcentratie door middel van de “Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration” formule. Voor analyse van het urinaire proteoom gebruikten we capillaire elektroforese gekoppeld met massaspectrometrie en voor analyse van het hartweefsel proteoom vloeistofchromatografie en tandem massaspectrometrie. Om metabolieten in het circulerend bloed te meten, pasten we nucleaire magnetische resonantiespectrometrie toe. In statistische regressieanalysen drukten we de effectgrootte uit per standaarddeviatie van de verklarende variabelen, in de meeste gevallen een biomerker.

Multidimensionele classificatiemerkers

In Hoofdstuk 2 onderzochten we de diagnostische nauwkeurigheid van multidimensionele urinaire classificatievariabelen. Hoofdstuk 2.1 was een bewijs-van-concept studie, waarbij we de resultaten van een patiënt-controle studie uitbreidden door in een dwarsdoorsnede (cross-sectionele) analyse van een bevolkingsstaal een verband te leggen tussen diastolisch linkerkamerfunctie en de urinaire multidimensionele classificatiemerkers HF1 en HF2, onderscheidenlijk bestaande uit 85 en 671 peptiden. In meervoudige regressie was HF1 geassocieerd met een 0.204 cm/s lagere e’ pieksnelheid (p=0,007) en een 0,145 hogere E/e’ ratio (p=0,020), terwijl HF2 geassocieerd was met een 0,174 hogere E/e’ ratio (p=0,008). Van de 745 deelnemers hadden 9% een verminderde linkerkamerrelaxatie en 13% een verhoogde E/e’ verhouding. In evenredig-risico (logistische) regressieanalyse was het meervoudig aangepaste relatief risico van een vertraagde relaxatie gerelateerd met HF1 1,38 (p=0,043) en dat van een toegenomen E/e’ ratio geassocieerd met HF2 1,38 (p=0,052). In Hoofdstuk 2.1 gingen we van een dwarsdoorsnede onderzoek over naar een longitudinale benadering door na te gaan of HF1 gemeten aan de basislijn correleerde met diastolische linkerkamerfunctie vijf jaar later. In continue analysen was een hogere basislijn HF1 een voorloper van een lagere e’ en een hogere E/e’ verhouding bij de opvolging (p≤0,043). In categorische analysen voorspelde een hogere basislijn HF1 subklinische diastolische linkerkamerdisfunctie (p=0,013). Bovendien verbeterde HF1 het discriminerend vermogen van de klassieke risicofactoren om personen met toekomstige linkerkamerdisfunctie te identificeren (p≤0,024). Zoals aangetoond in Hoofdstuk 2.3, voorspelde HF1 bij 791 FLEMENGHO deelnemers, die gedurende 6.1 jaar opgevolgd werden, 63 fatale plus niet-fatale cardiovasculaire verwikkelingen (uitvalrisico [hazard ratio, HR], 1,30; p=0,029) en 45 cardiale eindpunten (HR, 1,39; p=0,018). De overeenkomstige risicoverhoudingen voor systolisch bloeddruk waren 0,97 (p=0,85) en 0,93 (p=0,66). HF1 verbeterde de prognostische nauwkeurigheid van de klassieke risicomodellen (p≤0,006). In Hoofdstuk 2.4 verlieten we het begane pad van onze eerdere studies over HF1 en HF2 in de Vlaamse bevolking. In een patiënt-controle studie ontwikkelden en valideerden we een nieuwe multidimensionele urinaire classificatiemerker voor hartfalen, die we de naam “Heart Failure Predictor” (HFP) gaven. HFP bestaat uit 96 peptidefragmenten. In de testgegevens was de oppervlakte onder de diagnostische curve (ROC) 0,70 (p=0,0047) voor HFP en 0,57 (p=0,62) voor NT-proBNP.

In Hoofdstuk 2.5 focusten we op renale disfunctie. CKD273 bestaat uit 273 urinaire peptiden die gecombineerd bij patiënten met gevorderd nierfalen verdere achteruitgang van de nierfunctie voorspellen. Het Europees Geneesmiddelenagentschap (EMA) stelde recent voor om vroegere en zachtere eindpunten te gebruiken in longitudinale studies over chronisch nierlijden. Deze aanbeveling volgend deden we in Hoofdstuk 2.5 een meta-analyse op het niveau van het individu bij 2087 personen die deel uitmaakten van zes cohorten. Bij aanvang hadden alle deelnemers een geschatte glomerulaire filtratie van minstens 60 ml/min/1,73 m2, 74% hadden diabetes mellitus, en 6% hadden micro-albuminurie. Over een gemiddelde van vijf evaluatiepunten in de vervolgstudie daalde de glomerulaire filtratie meer met hogere basislijnwaarden van CKD273 dan met een hogere urinaire albumine excretie (‑1,64 vs. ‑0,82 ml/min/m2; p<0,0001). Een renaal eindpunt was een daling van de glomerulaire filtratie met minstens 10 ml/min/1,73 m2 tot minder dan 60 ml/min/1,73 m2. Over een periode van 4,6 jaar trad een eerste renaal eindpunt op bij 390 deelnemers, dat bij 172 resulteerde in een blijvende vermindering van de glomerulaire functie. Het risico van een eerste en blijvend renaal eindpunt verhoogde van het laagste naar het hoogste kwartiel voor zowel urinaire albumine excretie (p≤0,043) als CKD273 (p≤0,031) op de basislijn, maar in continue analysen verbeterde enkel CKD273 (p=0,039) het onderscheid tussen patiënten met een dalende versus bewaarde nierfunctie.

Mechanistische studies

In Hoofdstuk 3 onderzochten we de pathofysiologie van diastolische linkerkamerdisfunctie, hartfalen en chronisch nierlijden door identificatie van proteïnen gebaseerd op het urinair of cardiaal proteoom. In continue en categorische dwarsdoorsnede analysen (Hoofdstuk 3.1) was diastolische linkerkamerdisfunctie geassocieerd met hogere urinespiegels van collageen I fragmenten en lagere urinaire niveaus van collageen III afbraakproducten. De serumconcentratie van het carboxy-terminaal propeptide van pro-collageen I (PICP) is een merker van de synthese van collageen I. Carboxy-terminaal telopeptide collageen I (CITP) en de weefselinhibitor van matrix-metalloproteinases type 1 (TIMP‑1) zijn merkers van de afbraak van collageen I. Deze serummerkers van collageen I synthese en afbraak waren positief gecorreleerd met de urinaire collageen I fragmenten en negatief met de urinaire collageen III fragmenten. In overeenstemming met de urinaire resultaten, verminderde de diastolische linkerkamerfunctie met hogere serumconcentraties van CITP en TIMP‑1 (Hoofdstuk 3.1).

In Hoofdstuk 3.2 verlegden we de focus van het urinair naar het cardiaal proteoom. We bestudeerden myocardbiopsies van gezonde humane donorharten en van terminaal gedecompenseerde harten van patiënten met ischemische of gedilateerde cardiomyopathie. In beide ziekte entiteiten waren oxidatieve fosforylering en mitochondriale disfunctie de twee top canonieke metabole paden. De in de twee hartaandoeningen naar beneden afgestelde proteïnen waren betrokken in mitochondriale functies, terwijl de naar boven geregelde proteïnen afkomstig waren van de extracellulaire matrix of het circulerend bloed. Proteïnen betrokken in de balans tussen cellulaire dood en overleving, het behoud van genomische stabiliteit, transcriptie, calciumionfluxen, contractiliteit, signaaltransductie, het cellulaire skelet, cellulaire migratie, of de conformatie en het transport van proteïnen waren hetzij naar boven hetzij naar onder afgesteld.

In Hoofdstuk 3.3 bestudeerden we 74 urinaire peptiden met gekende aminozuursequentie die een meetbaar signaal hadden bij 95% van de studiedeelnemers van wie de glomerulaire nierfunctie was gemeten op de basislijn (n=805) of op de basislijn én tijdens opvolging (n=597). In dwarsdoorsnede analysen van de basislijngegevens daalde de glomerulaire filtratie met hogere urinaire spiegels van peptidefragmenten afkomstig van mucine‑1 (‑4,48 ml/min/1,73 m2), colageen III (‑2,84) en fibrinogeen (‑1,70). De glomerulaire filtratie was ook in twee richtingen geassocieerd met urinaire collageen I fragmenten (+2,28 en ‑3,20). Consistent hiermee waren de veranderingen in glomerulaire filtratie over 5 jaar (opvolging min basislijn) geassocieerd (p≤0,025) met de basislijnwaarden van de urinaire fragmenten van mucine‑1 (‑1,85), collageen (‑1,37 tot +1,43) en fibrinogeen (‑1,45). Het relatief risico om chronisch nierlijden stadium 3 te hebben in het dwarsdoorsnede onderzoek of chronisch nierlijden stadium 3 te ontwikkelen in de vervolgstudie, was sterk geassocieerd met mucine‑1. In vergelijking met micro-albuminurie was mucine‑1 een meer performante voorspeller. Kort samengevat onderstreepten onze bevindingen in Hoofdstuk 3 dat een gestoord profibrotisch collageenmetabolisme geassocieerd is zowel met linkerkamerdisfunctie als met nierlijden en dat een urinair fragment van de a-keten van mucine‑1 een vroegtijdige voorloper is van nierlijden.

Metabole studies

In Hoofdstuk 4 onderzochten we het metaboloom in het circulerende bloed eerst in een dwarsdoorsnede onderzoek van de basislijngegevens van 711 FLEMENGHO deelnemers (Hoofdstuk 4.1) en vervolgens in dwarsdoorsnede analysen van zowel de gegevens aan de basislijn als de vervolggegevens én in een longitudinale analyse, waarbij we bij 570 deelnemers de diastolische linkerkamerfunctie relateerden met circulerende metabolieten die 5 jaar eerder gemeten werden. In partieel kleinste-kwadraatregressie (PLS), waarbij de dwarsdoorsnede gegevens op de basislijn en bij opvolging betrokken werden, stelden we vast dat de volgende circulerende metabolieten consistent geassocieerd waren met een betere diastolische linkerkamerfunctie: 2‑aminobutyraat, leucine en 4‑hydroxybutyraat. De metabolieten glucose + glutamine en valeraat waren stelselmatig geassocieerd met een verminderde diastolische linkerkamerfunctie. Het metabolisme van vertakte aminozuren en de amino-acyl tRNA biosynthese waren de top metabole trajecten geassocieerd met diastolische linkerkamerdisfunctie.

Besluit en toekomstperspectief

Deze doctoraatsverhandeling levert een sterk betoog ten voordele van verder onderzoek dat moet toelaten multidimensionele urinaire classificatiemerkers te introduceren in de klinische praktijk. In dwarsdoorsnede onderzoek en over een termijn van 5 jaar was diastolische linkerkamerdisfunctie geassocieerd met HF1. Deze urinaire biomerker voorspelde bovendien nieuwe cardiovasculaire en cardiale verwikkelingen. HF1, HF2 en HFP zijn urinaire biomerkers die hoofdzakelijk bestaan uit ontregelde collageenfragmenten en reflecteren waarschijnlijk de herschikking van de cardiale extracellulaire matrix. Het Amerikaanse Geneesmiddelenagentschap (FDA) moedigt verder onderzoek aan naar CKD273 als biomerker van nierlijden. CKD273 voorspelt vroegtijdig de achteruitgang van de nierfunctie en is al goedgekeurd voor klinisch gebruik in Duitsland. Vanuit een mechanistisch oogpunt verdiepten urinaire peptiden met gekende aminozuursequentie ons inzicht in de pathofysiologie van cardiale en renale disfunctie. In het Vlaams bevolkingsonderzoek (Hoofdstuk 3.3) met replicatie in een cohorte overwegend bestaande uit diabetespatiënten (Hoofdstuk 2.5, Tabel S1) voorspelde urinair verlies van de a keten van mucine‑1, een proteïne aangemaakt door het renale tubulaire epithelium achteruitgang van de nierfunctie en in deze rol overtrof urinair microalbumine. In dwarsdoorsnede en longitudinale studies vonden we consistentie in de samenhang van diastolische linkerkamerdisfunctie met circulerende metabole biomerkers. Bovenop afwijkingen in de balans tussen aëroob en anaëroob energiegebruik, identificeerden we het metabolisme van vertakte aminozuren en de amino-acyl tRNA biosynthese als top canonieke moleculaire paden betrokken in diastolische linkerkamerdisfunctie. Het toekomstperspectief gesteund op de bevindingen van deze doctoraatsverhandeling is de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen en de individualisering van levensstijlinterventies, de enige richtlijn-ondersteunde maatregel voor het voorkomen van diastolisch linkerkamerdisfunctie. Dit succesverhaal lijkt nu binnen handbereik te komen.