Onderzoek naar de rol van de HIV enveloppe glycanen in de virale infectie en de antivrale activiteit van suiker-bindende moleculen.

Het humaan immunodeficiëntie virus (HIV) veroorzaakt een ernstig immunodeficiëntiesyndroom, beter gekend als AIDS (acquired immunodeficiency syndrome). Hoewel intensief onderzoek ertoe geleid heeft dat er inmiddels meer dan 25 anti-HIV medicamenten voorradig zijn, blijft deze pandemie een groot probleem voor de wereldwijde volksgezondheid. Nog steeds worden er jaarlijks ongeveer 2,1 miljoen mensen geïnfecteerd met het virus en sterven er zowat 1,5 miljoen mensen aan de gevolgen van AIDS. Er is dus nog steeds een continue nood aan de ontwikkeling van nieuwe strategieën voor het behandelen van HIV-geïnfecteerde individuen en het voorkomen van de verdere verspreiding van HIV.

Het HIV-partikel is omgeven door een lipidenlaag, de virale enveloppe, waarop zich de glycoproteïnen gp120 en gp41 bevinden. Deze glycoproteïnen spelen een cruciale rol tijdens één van de eerste stappen van de replicatiecyclus van HIV, namelijk tijdens het binnentreden van het virus in zijn doelwitcellen (‘HIV entry’). Omdat gp120 en gp41 hierbij onmisbaar zijn, fungeren deze glycoproteïnen als interessante doelwitten voor het ontwikkelen van anti-HIV medicatie. Deze moleculen zouden dan ook de virale replicatie kunnen blokkeren in een zeer vroeg stadium, vooraleer het viraal genoom onomkeerbaar geïntegreerd is in het cellulair genoom. Het doel van deze doctoraatsthesis was daarom enerzijds om het antiviraal potentieel van twee verschillende klassen van HIV entry inhibitoren te onderzoeken (hoofdstuk 3), en anderzijds om gedetailleerd onderzoek te doen naar de HIV enveloppe glycoproteïnen, met een focus op de vele N-gekoppelde glycanen en disulfidebruggen van HIV gp120 en gp41 (hoofdstuk 4).

In hoofdstuk 3 werd het antiviraal potentieel van twee klassen van HIV entry inhibitoren onderzocht, namelijk suikerbindende moleculen (carbohydrate-binding agents, CBAs) en tellurium(Te)-bevattende oxidoreductase inhibitoren. De groep van CBAs omvat moleculen met variabele structuren en origine die in staat zijn om HIV entry te inhiberen door specifiek te interageren met talrijke N-gekoppelde glycanen van HIV gp120. De Te-bevattende oxidoreductase inhibitoren, daarentegen, blokkeren HIV entry door te interfereren met de obligate reductie van disulfidebruggen van HIV gp120 tijdens HIV entry. Dit reductieproces wordt gemedieerd door cellulare oxidoreductase enzymen en is cruciaal voor het induceren van de nodige conformationele veranderingen in HIV gp120 en gp41 tijdens HIV entry.

We konden aantonen dat de CBAs erg effectief zijn in het blokkeren van vier processen die een rol spelen bij HIV infectie en transmissie: de celvrije virus infectie van CD4+ T-lymfocyten, de vorming van syncytia tussen HIV-geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde CD4+ T-cellen, het binden van viruspartikels door DC-SIGN en het doorgeven van DC-SIGN-gebonden viruspartikels naar CD4+ T-cellen (sectie 3.1). Daarnaast konden we ook aantonen dat CBAs geen meetbaar nadelig effect hebben op de groei, overleving en epitheliale adhesie van een brede waaier van vaginale en niet-vaginale Lactobacillus stammen (sectie 3.1). Deze bacteriën dragen in grote mate bij tot de gezonde vaginale microflora en zijn uitermate belangrijk voor de vaginale homeostase en de inherente antimicrobiële afweer van de vaginale omgeving. Uit deze data konden we concluderen dat CBAs interessant zijn voor het ontwikkelen van nieuwe anti-HIV medicamenten, inclusief voor de ontwikkeling van topicale microbiciden.

In sectie 3.2 hebben we onderzocht wat het effect is van het rationeel combineren van twee CBAs met een verschillend glycaan-bindingsprofiel op het ontwikkelen van CBA-resistentie. We konden aantonen dat de combinatie van twee specifieke CBAs leidde tot een vertraagde ontwikkeling van CBA-resistentie en dat er bij deze mutante virusstammen verschillende (voornamelijk mannose-rijke) N-gekoppelde glycanen weggemuteerd waren (sectie 3.2). Deze CBA-resistente virussen bleken een lagere virale infectiviteit te hebben dan het originele (niet-resistente) virus. Deze bevindingen tonen aan dat de antivirale activiteit van CBAs (zoals beschreven in sectie 3.1) mogelijks vergroot kan worden door het rationeel combineren van specifieke CBAs met een verschillend glycaan-bindingsprofiel, en dat het blootstellen van HIV aan CBAs leidt tot de selectie van mutante virusstammen met een gecompromitteerde infectiviteit.

Voor een andere klasse van anti-HIV moleculen die we onderzochten, namelijk tellurium(Te)-bevattende oxidoreductase inhibitoren (sectie 3.3), was eerder aangetoond dat deze moleculen het thioredoxine reductase-1 (TrxR1) inhiberen. Dit enzyme kan samen met thioredoxin-1 (Trx1) specifieke disulfidebruggen in HIV gp120 reduceren tijdens HIV entry, waardoor er noodzakelijke conformationele veranderingen in HIV gp120 en gp41 worden geïnduceerd. Ons gedetailleerd onderzoek naar het moleculair mechanisme van de antivirale activiteit van de Te-compounds bevestigde dat deze producten de HIV entry blokkeren door de Trx1/TrxR1-gemedieerde reductie van disulfidebruggen in HIV gp120 te blokkeren. We konden ook aantonen dat het TrxR1 nauw geassocieerd is met het viruspartikel. Hoewel de Te-bevattende moleculen interfereren met HIV entry, zijn zij vaak ook geassocieerd met beduidende cellulaire toxiciteit. We konden daarom besluiten dat het Trx1/TrxR-systeem een interessant doelwit is voor de ontwikkeling van nieuwe HIV entry inhibitoren, maar dat daarvoor bijkomende TrxR1 inhibitoren ontworpen moeten worden met een nog betere activiteit en een lagere toxiciteit.

In hoofdstuk 4 werden de N-glycanen en disulfidebruggen van HIV gp120 en gp41 grondig onderzocht, met de bedoeling om meer inzicht te verwerven in de functionele en spatiële rol van deze structurele elementen voor de functionaliteit van de HIV enveloppe glycoproteïnen. Voor deze experimenten werden verschillende mutante HIV stammen gemaakt waarbij N-glycanen of disulfidebruggen selectief geëlimineerd werden m.b.v. gerichte mutagenese van het virale Env gen.

In sectie 4.2 hebben we de N-glycaan op asparagine-262 van HIV gp120 in meer detail onderzocht. Het was eerder al aangetoond dat deze glycaan uitermate belangrijk is voor de infectiviteit van het virus en de correcte expressie en enveloppe-incorporatie van de virale glycoproteïnen. Uit ons onderzoek bleek dat de deletie van deze glycaan in HIV gp120 leidt tot de lysosomale degradatie van de enveloppe glycoproteïneprecursor gp160, waardoor de verdere biosynthese en enveloppe-incorporatie van gp120 en gp41 ernstig verstoord wordt.

We hebben ontdekt dat gp41 een N-glycaan op asparagine-616 bevat die onontbeerlijk is voor de infectiviteit van verschillende HIV stammen (sectie 4.1). Het elimineren van de andere N-glycanen van gp41 (zelfs combinaties van 2 tot 3 N-glycaandeleties) had geen of slechts een beperkt effect op de virale infectiviteit en had slechts een kleine invloed op de gevoeligheid van deze mutante virusstammen voor de antivirale activiteit van CBAs. Deze bevindingen tonen aan dat de antivirale activiteit van CBAs voornamelijk te wijten is aan de interactie van deze CBAs met de mannose-rijke glycanen op HIV gp120, en niet zozeer op HIV gp41.

We hebben ook onderzoek verricht naar de spatiële organisatie en het onderling verband tussen N-glycanen en disulfidebruggen in HIV gp120 (sectie 4.3). Hieruit bleek dat de aanwezigheid of afwezigheid van N-glycanen in de nabijheid van disulfidebruggen in HIV gp120 vaak sterk gereguleerd is en dat sommige disulfidebruggen noodzakelijk omgeven zijn door minstens één geconserveerde N-glycaan. De deletie van bepaalde glycanen in de nabijheid van disulfidebruggen in HIV gp120, of het invoegen van extra N-glycanen dichtbij disulfidebruggen op posities die normaal niet geglycosyleerd zijn, heeft vaak een zeer nadelig effect op de virale functies. Deze bevindingen tonen aan dat disulfidebruggen en N-glycanen niet willekeurig verspreid zijn over HIV gp120 en dat de colocalisatie van deze structurele elementen bijdraagt tot de virale infectiviteit en transmissie. De strikte regulatie van de N-glycaanomgeving van bepaalde disulfidebruggen van gp120 zou dus gebruikt kunnen worden als hot-spot voor de ontwikkeling van nieuwe, gerichte en potentieel erg actieve anti-HIV medicatie.

Uit deze doctoraatsthesis kunnen we concluderen dat de HIV enveloppe glycoproteïnen interessante doelwitten zijn voor de ontwikkeling van nieuwe antiretrovirale medicatie die het mogelijk maakt om één van de eerste stappen van de virale replicatie te blokkeren. Dit hebben we aangetoond enerzijds m.b.v. moleculen die specifiek interageren met de suikerstructuren op HIV gp120, en anderzijds m.b.v. moleculen die interfereren met de oxidoreductie-gemedieerde conformationele veranderingen in HIV gp120 tijdens HIV entry. Daarnaast is ook gebleken dat sommige N-glycanen van de HIV enveloppe glycoproteïnen van groot belang zijn voor de virale functies. Met ons onderzoek hebben we bijgedragen tot een beter inzicht in de fundamentele rol van deze N-glycanen op HIV gp120 en gp41 in de biosynthese en functie van de HIV enveloppe glycoproteïnen. Onze resultaten suggereren dat bepaalde onmisbare N-glycanen van HIV gp120 en gp41 mogelijks erg interessante doelwitten zijn voor de ontwikkeling van krachtige en selectieve antiretrovirale middelen.