Ontwikkeling en validatie van antilichaam- en MIP-beladen poreuze draagstructuren voor multi-mycotoxine analyse

Mycotoxinen zijn contaminanten die geproduceerd worden door verscheidene schimmelspecies en die aanwezig kunnen zijn in diverse voedings- en voerdermatrices. Volgend op contaminatie kunnen deze secundaire metabolieten uiteenlopende toxische effecten veroorzaken bij zowel mens als dier, ondanks dat ze meestal slechts aanwezig zijn in lage ppb-ppt concentraties. De mycotoxine problematiek is een wereldwijde bezorgdheid die reeds geleid heeft tot verscheidene nationale en Europese aanbevelingen, richtlijnen en verordeningen met betrekking tot maximale mycotoxine gehalten. Wetgeving is absoluut noodzakelijk aangezien economische verliezen als gevolg van contaminaties niet te onderschatten zijn. Zo bestaan er bijvoorbeeld verordeningen met betrekking tot maximale gehalten voor ergot alkaloïd sclerotia en deoxynivalenol (DON) in diverse voedings- en voedermatrices. Bijgevolg is een snelle, accurate en gevoelige mycotoxine analyse vereist om mycotoxinen in stalen te kunnen identificeren en kwantificeren. Mycotoxine analyse bestaat hiervoor uit screeningstesten en bevestigingsmethoden waarbij de focus ligt op multimycotoxine detectie. Enerzijds gebruiken de bestaande sneltesten vaak antilichamen als specifieke herkenningselementen maar deze zijn gekenmerkt door een aantal belangrijke nadelen. Anderzijds is staalopzuivering voorafgaand aan LC-MS/MS als bevestigingsanalyse vaak gebaseerd op niet-selectieve interacties (Hoofdstuk 1). Om te voldoen aan de bestaande vraag naar meer performante analytische hulpmiddelen en methoden voor snelle, gevoelige, robuuste en selectieve multi-mycotoxine analyse wordt een nieuw type van vaste-fase opzuivering (SPE) sorbenten voorgesteld gebaseerd op poreuze draagstructuren. Deze draagstructuren werden geproduceerd aan de hand van de BioplotterTM technologie en vervolgens beladen met herkenningselementen. Naast antilichamen die de gouden standaard zijn in mycotoxine analyse werden de populaire synthetische alternatieve molecularly imprinted polymers (MIP) gebruikt voor immobilisatie op poly-ε-caprolacton (PCL) draagstructuren. Hiervoor zijn sferische MIP partikels met groottes in de sub-micrometer orde gewenst. Na productie en karakterisatie van de partikels werden de optimale MIP immobilisatie parameters bestudeerd op 2D PCL oppervlakken, net als voor de antilichamen, en gevolgd door transfer naar de meer complexe 3D vorm voor SPE toepassingen (Hoofdstuk 2).

In een eerste deel van dit onderzoek werden MIP geproduceerd als herkenningselementen voor de zes belangrijkste ergot alkaloïden en hun epimeren. MIP zijn synthetische herkenningselementen die in staat zijn interacties aan te gaan met een doelanaliet om een selectieve binding, detectie en/of eliminatie hiervan te bekomen. Deze partikels kunnen geproduceerd worden door verschillende polymerisatie mechanismen en technieken. MIP voor ergot alkaloïden werden geproduceerd door gebruik te maken van metergoline als templaat, methacryl zuur als functioneel monomeer en trimethylolpropaan trimethacrylaat als crosslinker in precipitatie polymerisatie met acetonitrile als solvent. Verscheidene karakterisatietechnieken voor partikels werden onderzocht en geëvalueerd. Een eerste groep bevat morfologische karakterisatiemethoden zoals elektronen microscopie en partikelgrootte analyse. Door gebruik te maken van deze technieken werden de productie en het droogproces van de gewenste MIP partikels geoptimaliseerd. Dit resulteerde in sferische partikels in de sub-micrometer grootte orde waarbij aggregatieproblemen geobserveerd werden. Een 1/6/24 verhouding van templaat/functioneel monomeer/crosslinker werd geselecteerd voor verdere experimenten. Daarnaast zijn er technieken beschikbaar nucleaire magnetische resonantie spectroscopie en thermo-gravimetrische analyse voor respectievelijk chemische structuur analyse en bepaling van thermische karakteristieken. Tenslotte kan de selectieve binding van het doelanaliet bestudeerd worden met vloeistof chromatografie gekoppeld aan verscheidene detectoren. Binnen dit onderzoek toonden evenwichtsexperimenten via LCMS/ MS duidelijk aan dat MIP een hogere metergoline bindingscapaciteit vertonen in vergelijken met de non-imprinted polymers (NIP). Deze observatie werd echter niet bevestigd voor de binding van de ergot alkaloiden in acetonitrile. Bijgevolg werden verschillende mengsels van acetonitrile met buffers getest waarbij de hoogste recovery gevonden werd indien ACN/[KH2PO4/HCl]-buffer pH3 (80/20) gebruikt werd als laadsolvent. De MIP recoveries varieerden van 45.06 ± 2.65 % voor Ecr(n) tot 48.93 ± 6.73 % voor Em(n) welke significant hoger lagen in vergelijking met de NIP. Deze percentages waren niet zo hoog als initieel verwacht wat mogelijks gerelateerd zou kunnen zijn aan partikel aggregatie. Samenvattend toont Hoofdstuk 3 aan dat sferische MIP partikels met sub-micrometer groottes verkregen werden. Vervolgens konden deze geïmmobiliseerd worden op oppervlakken en 3D structuren ondanks de niet optimale functionaliteit met betrekking tot de herkenning van ergot alkaloïden.

Hoofdstuk 4 beschrijft de immobilisatie van MIP partikels op 2D gespincoate PCL oppervlakken met behulp van Pluronic® F127 bismethacrylaat (PF127-BMA) bouwstenen. Doorgaans wordt de succesvolle immobilisatie van MIP structuren zoals geïmmobiliseerde partikels en films op oppervlakken bestudeerd door elektronen microscopie, atomaire kracht microscopie, statische contacthoek metingen, X-straal foto-elektron spectroscopie (XPS), kwartskristal microbalans en oppervlakte plasmon resonantie. Verschillende condities werden getest voor de immobilisatie van MIP voor ergot alkaloïden door de solvent verhoudingen en de concentratie aan hydrogel bouwstenen te variëren. Omwille van de aggregatie van MIP partikels in MilliQ water werd de hydrogel bouwsteen-MIP oplossing finaal bereid in 50/50 acetonitrile/MilliQ. Verder werd de 7.5 w% PF127-BMA concentratie geselecteerd voor succesvolle MIP immobilisatie met een laag risico op het bedekken van de MIP door de hydrogel laag en daaropvolgende afname in bindingscapaciteit. Daarnaast werd het 7.5 w% PF127-BMA netwerk niet verstoord door de aanwezigheid van de MIP partikels. Bijgevolg werden deze geoptimaliseerde condities getransfereerd naar de 3D MISPE applicatie. Succesvolle immobilisatie van MIP partikels op 3D PCL poreuze draagstructuren door 7.5 w% PF127-BMA werd aangetoond door microscopie en μCT analyse. De aanwezigheid van de hydrogel werd in sommige gevallen echter ook geobserveerd in de poriën van de draagstructuren wat mogelijks de finale perfusie tijdens SPE kan beïnvloeden. Het hoogste specifieke bindingspercentage voor een 1 μM metergoline oplossing werd gevonden bij het uitvoeren van slechts één wasstap en bedroeg 44.87 ± 8.30 %, hetgeen lager was als initieel vooropgesteld. Daarnaast ondervonden de ergot alkaloïden geen specifieke retentie door het MIP sorbent. De aanwezigheid van MIP partikels na SPE werd bevestigd via SEM analyse en toonde aan dat er geen verlies kon waargenomen worden. Vervolgens werden verschillende hypothesen geformuleerd die mogelijks een verklaring zouden kunnen bieden voor de lage bindingscapaciteit van het nieuwe type SPE kolommen. Bijgevolg werd finale optimalisatie van de multi-ergot alkaloïd MISPE toepassing gebaseerd op beladen draagstructuren niet bekomen in Hoofdstuk 5. In het tweede deel van dit onderzoek werden antilichamen gebruikt als herkenningselementen op de PCL draagstructuren als SPE sorbenten voor de detectie van DON. Hiervoor werden primaire aminefuncties geïntroduceerd op het PCL oppervlak door gebruik te maken van de 2-aminoethyl methacrylaat (AEMA) grafting technologie. Voorafgaand aan de immobilisatie van anti-DON antilichamen werden secundaire antilichamen geïmmobiliseerd op 2D PCL substraten. Initieel werd de immobilisatie van de secundaire antilichamen geoptimaliseerd door toepassing van verschillende modellen en concentraties. Zowel een ionair als een covalent model werd gebruikt om 0.0021 μg/μl, 0.0042 μg/μl, 0.0084 μg/μl en 0.0168 μg/μl secundaire antilichaam oplossingen te immobiliseren. Na karakterisatie door XPS en radiolabeling analyse kon er geconcludeerd worden dat binnen deze toepassing het ionaire model niet resulteerde in een voldoende afzetting van secundaire antilichamen. Daarentegen was de 0.0084 μg/μl concentratie de optimale verdunning van secundaire antilichamen, gecombineerd met het covalente immobilisatie model. Vervolgens konden deze parameters getransfereerd worden naar de 3D antilichaam SPE opstelling. (Hoofdstuk 6) In Hoofdstuk 7 werd de specifieke covalente immobilisatie van een 0.0084 μg/μl secundaire antilichaam oplossing op 3D PCL scaffolds bevestigd door radiolabeling en μCT-SPECT analyse. Een hoeveelheid van 11.74 ± 0.10 μg secundair antilichaam werd geïmmobiliseerd op PCL draagstructuren gefunctionaliseerd met AEMA, hetgeen overeenstemt met een rendement van 41.93 %. Daarenboven vertoonden de randen van de draagstructuren een hogere hoeveelheid aan geïmmobiliseerde antilichamen wat gerelateerd zou kunnen zijn aan het immobilisatieprotocol. In het centrum van de draagstructuren waren de secundaire antilichamen echter geïmmobiliseerd met een aanvaardbare homogeniciteit, variabiliteit en reproduceerbaarheid. Daarnaast waren de antilichamen aanwezig op de poriën wat positieve verwachtingen schiep naar de finale SPE applicatie toe. Ondanks deze veelbelovende resultaten werd er geen selectieve binding van DON waargenomen. Net zoals bij de MIP 3D sorbenten werden verschillende oorzaken beschreven die mogelijks gerelateerd kunnen zijn met de lage affiniteit van de nieuwe sorbenten tegenover DON. Bijgevolg is verdere optimalisatie noodzakelijk om dit type van sorbenten te gebruiken in nieuwe SPE toepassingen voor de detectie van mycotoxinen. Er kan geconcludeerd worden dat er, ondanks de succesvolle immobilisatie van de herkenningselementen, geen optimale SPE condities konden verkregen worden die resulteerden in de specifieke binding van ergot alkaloïden en DON door respectievelijk MIP en antilichamen geïmmobiliseerd op PCL draagstructuren. Bijgevolg vereisen de nieuwe types van antilichaam en MIP beladen poreuze sorbenten verdere optimalisatie voordat ze gebruikt kunnen worden in SPE toepassingen voorafgaand aan LC-MS/MS analyse en/of in snelle screeningstesten gecombineerd met quantum dots als labels. Daarnaast dienen de stabiliteit en herbruikbaarheid bestudeerd te worden, samen met het testen van echte stalen en validatie van de nieuwe methoden. (Toekomstperspectieven)