Ontwikkeling van een differentieel LAPS-gebaseerd monitoringsysteem om de metabolische respons van bacteriën in biogasprocesanalyses te evalueren

De onafhankelijkheid van fossiele brandstoffen als dragers van energie is een van de meest belangrijke doelen van alle landen op Aarde. De negatieve gevolgen van de globale klimaatverandering zijn op vele plaatsen nu al voelbaar in het dagelijks leven. Onverwachte natuurrampen beïnvloeden het leven van vele mensen en doen hen nadenken over gepaste, nieuwe strategieën om toekomstige rampen op een gepaste manier het hoofd te bieden. In dit verband groeit de vraag naar wetenschappelijk onderzoek en methoden om schade te beperken en om te voorkomen dat irreversibele en dure ingrepen nodig zouden worden. Onderzoek en innovatie op het gebied van hernieuwbare energiebronnen spelen hierin een vooraanstaande rol. Reeds sinds enkele decennia is er echter ook een dynamiek aan de gang die het in toenemende mate mogelijk maakt om energie uit hernieuwbare bronnen te winnen, al dan niet in de vorm van biologische energiedragers. 

De huidige technologieën leggen de klemtoon op de Zon, wind, waterkracht, geothermie en biomaterialen als alternatieve energiebronnen. Tussen al deze ressources speelt ook de productie van biogas een belangrijke rol en energiewinning uit biomassa heeft nieuwe moge-lijkheden geopend voor de productie en transformatie van energie. Historische bronnen uit het Oude China en Perzië documenteren dat er toen al kennis bestond om thermische energie te genereren met behulp van biogas-bronnen zoals dierlijke mest en plantenafval. Sindsdien zijn de wetenschappelijke technologische ontwikkelingen hieromtrent enorm gegroeid, zij aan zij met vooruitgang in andere toepassingsgebieden. Ondanks de kennis uit de Oudheid om methaangas te produceren is ook de hedendaagse biogasproductie nog steeds een complex proces waarin verschillende disciplines uit wetenschap en technologie samen komen en elkaar aanvullen. Dit omvat bv. de microbiologie van bacteriën, nanotechnologie, telecommunicatie, processturing en automatisatie om slechts enkele facetten van het onderzoeksdomein te vermelden. De huidige stand van kennis omvat veelbelovende oplossingen en strategieën om toekomstige uitdagingen aan te kunnen. In functie van het substraat (de grondstof) voor de biogasproductie kunnen verschillende micro-organismen worden ingezet. Over het algemeen bestaan fermentatieprocessen uit vier deelstappen die echter simultaan plaatsvinden: De hydro-lyse, de acidogenese, de acetogenese en de methanogenese. Bij elke stap speelt een bepaald bacteriën-type de hoofdrol waarbij de biomassa eerst wordt afgebroken om finaal tot methaan te worden omgezet. De functie van de micro-organismen staat bij fermentatie-processen dus centraal.

Enkel gezonde en metabolisch actieve micro-organismen kunnen tot een fermentatieproces bijdragen die naar behoren verloopt om zo methaan te produceren. Bijgevolg is de metabolische activiteit van de bacteriën een belangrijke procesparameter als het erom gaat de operationele status van een biogasreactor te analyseren. Naast andere parameters zoals de concentratie van vluchtige vetzuren, pH-waarde, redoxpotential en de temperatuur, is de globale extracellulaire acidificatie van de bacteriën een belangrijk instrument en kenmerk om uitsluitsel te verkrijgen over de intermediaire stappen tijdens een fermentatieproces. 

Mochten er storingen in het proces optreden die aan de micro-organismen te wijten zijn dan is de keten van biochemische reacties onderbroken en de gas-synthese valt stil. Dit is vaak met hoge kosten verbonden en bovendien tijdrovend omdat de bioreactor opnieuw gevuld moet worden om het proces opnieuw op te starten. Bijgevolg is het wenselijk om over een online-monitoring systeem te beschikken dat het cellulaire metabolisme van de bacteriën in de bioreactor nauwgezet opvolgt. Er bestaan reeds verschillende conventionele, commercieel beschikbare technieken om het verloop van biogas-processen te evalueren en het inleidend hoofdstuk van deze thesis geeft hieromtrent een ruim overzicht. Men moet zich echter ervan bewust zijn dat het merendeel van deze technieken gebonden is aan offline laboanalyses. Dit veroorzaakt niet enkel kosten door de benodigde apparatuur maar zorgt ook voor een aanzienlijke vertraging tussen de staalname en de beschikbaarheid van de precieze analytische gegevens. Bijgevolg zou een online-meetsysteem duidelijke voordelen bieden, meer bepaald een systeem dat naast een biogas-reactor werkt of zelfs erop kan worden aangesloten. De meting kan dan onmiddellijk na de staalname gebeuren, wat niet enkel een tijdswinst betekent maar ook het reëel risico beperkt dat de staaleigenschappen tijdens het transport zouden wijzigen. Over de laatste 30 jaar is de belangstelling voor analytische (bio-) sensoren enorm gegroeid waarbij niet enkel de analyse maar, in toenemende mate, ook het continue monitoren tot de mogelijkheden van deze sensoren behoort. Een subtype van deze sensoren, de lichtgevoelige potentiometrische sensoren (LAPS), kwam hierbij in de belangstelling omwille van hun toe-nemende performantie en hun uitleesprincipe dat toelaat concentratieveranderingen in waterige oplossingen te volgen in functie van de tijd en met ruimtelijke resolutie. De details hieromtrent worden in het theoriegedeelte van deze thesis uiteengezet.

Dit werk richt zich centraal op de ontwikkeling en optimalisatie van een differentieel sensor-systeem dat op het werkingsprincipe van LAPS berust om het metabolisch gedrag van verschillende bacteriëntypes te monitoren. Hiertoe werden verschillende LAPS chips met behulp van microfabricage op basis van dunne-film- en planaire silicium-technologie vervaar-digd en vervolgens zowel fysisch als elektrochemisch gekarakteriseerd. In de volgende stap werden 3D-gedrukte meetcompartimenten ontworpen, gemaakt van polymeren en met verschillende geometrieën. Door deze compartimenten op de chips te installeren werden verschillende gevoelige velden op de chips gedefinieerd, teneinde differentieel te kunnen meten. De differentiële aanpak laat toe om ongewenste storingen tijdens de metingen te ondervangen zoals veranderingen in de pH door toevoeging van media, drift van het sensor-signaal en schommelingen van de temperatuur. De kenmerken en prestaties van de nieuw ontwikkelde meer-kanaals-LAPS set-up werden met Escherichia coli (E. coli) K12 bacteriën gekarakteriseerd en vergeleken met eerdere resultaten uit de wetenschappelijk literatuur. Initieel werd hierbij een array van 16 lichtemitterende dioden (LEDs) als lichtbron gebruikt wat echter tot een ongewenste daling van het meetsignaal van het referentie-meetcompartiment (zonder cellen) leidde. Dit werd verholpen door de ontwikkeling van een nieuwe lichtbron, bestaande uit 16 regelbare laser-dioden modules (LDMs) met vaste focus, waarmee de verschil-lende compartimenten op de LAPS chip zoals gewenst aangestuurd konden worden zonder onderlinge interferentie. De LDMs zijn frequentie-gemoduleerd

 dankzij een programmeerbare gate array (FPGA controller) en na aanpassingen aan de LAPS set-up werden simultane metingen op de verschillende chip-compartimenten mogelijk door de LDMs aan te sturen op verschillende frequenties. Voorts hebben LDMs een veel kleinere straaldiverentie dan LEDs waardoor het referentiesignaal tijdens alle metingen stabiel kon blijven. In functie van het aantal meetcompartimenten op de chip werden ofwel twee ofwel vier Ag/AgCl referentie-elektroden in het LAPS-systeem geïntegreerd wat echter potentiaalverschillen tussen de compartimenten tot gevolg had. Dit werd opgelost door een bijkomende 3D-structuur waarbij een enkele referentie-elektrode door middel van zoutbruggen met alle compartimenten werd verbonden die bijgevolg dan ook identieke waarden van de elektroden-potentiaal vertoonden.

Na validatie van het sensor-systeem en de selectie van geschikte zuurvormende, facultatief-anaerobe modelbacteriën voor LAPS-metingen werd de extracellulaire acidificatie van drie verschillende bacteriëntypes bepaald: Escherichia coli (E. coli), Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum) en Lactobacillus brevis (L. brevis). Het metabolisch respons van E. coli, C. glutamicum en L. brevis op de toediening en opname van glucose werd dan met behulp van het differentiële LAPS systeem in kaart gebracht. Hierbij werd de extracellulaire acidificatie voor verschillende glucose-concentraties en aantallen bacteriën gemeten in functie van de tijd om zodoende kalibratiecurves te verkrijgen die karakteristiek zijn voor het metabolisch gedrag van elke bacteriënsoort. Na sequentiële metingen met elk micro-organisme apart werden ook simul-tane metingen met alle bacteriën op eenzelfde LAPS chip uitgevoerd en werden de resultaten onderling vergeleken.

Tenslotte werd het cellulaire metabolisme van echte vloeistofstalen uit een papier-gebaseerde biogas-fermenter geanalyseerd. Hierbij werd de totale acidificatie van de bacteriënpopulaties in de fermentatievloeistof door toediening van glucose bepaald om de bijhorende kalibratie-curves op te stellen. Nadien werden de drie boven vermelde micro-organismen blootgesteld aan vloeistof uit de fermenter, afkomstig uit schillende fazen van het biogas-proces, om uitsluitsel te krijgen in hoeverre deze vloeistof het metabolisch gedrag van deze model-organismen beïnvloedt. Het differentiële LAPS-meetsysteem werd dus met succes toegepast om niet enkel de metabolische activiteit van verschillende types van micro-organismen te documenteren, maar ook om het gedrag van bacteriënpopulaties in papier-gebaseerde fermentatievloeistof te analyseren. De resultaten van dit werk tonen aan dat de ontwikkelde sensor, steunend op het differentiële LAPS principe, een opmerkelijk potentiaal heeft om metabolische processen van verschillende bacteriën te monitoren en hierdoor een belangrijke bijdrage te leveren aan de analyse van biologische fermentatieprocessen.