Ontwikkeling van een nieuwe antivirale strategie gericht tegen de nucleaire import van HIV.

Insertie van het viraal genoom in het chromatine van een gastheercel istyperend voor de replicatie van het humaan immunodeficiëntievirus (HIV-1). Deze stap, die gekatalyseerd wordt door het virale integrase (IN) enzym, verbindt onomkeerbaar het lot van het provirus met dat van de cel. Onderzoek op IN is echter geen sinecure gebleken. Desondanks zijn er in het laatste decennium een aantal doorbraken en inzichten geweest die hetveld vooruit gestuwd hebben. Deze thesis bundelt vijf onderzoeksmanuscripten die elk een andere onderzoeksvraag rond HIV-1 IN beantwoorden. Allemaal handelen ze echter over de structuur, functie en inhibitie van IN.

Sinds de goedkeuring van raltegravir in 2007 zijn IN-strengtransferinhibitoren (INSTIs) integraal deel gaan uitmaken van antiretroviraletherapie. Drie INSTIs worden momenteel gebruikt in klinische settings waar ze zorgen voor een sterke inhibitie van de virale replicatie en een dramatische reductie in de virale lading. Het verschijnen van resistentevirussen maakt echter duidelijk dat er nood is aan een nieuwe generatievan IN-actieve-siteïnhibitoren met een gunstiger resistentieprofiel. Inhoofdstuk 3 beschrijven we een derivaat van 2-hydroxyisoquinoline-1,3(2H,4H)-dione (MB-76) dat de integratie van wild-type en raltegravir-resistente virussen sterk blokkeert. Een kristalstructuur van MB-76 gebonden aan integrase van humaan spumaretrovirus toont een bindingswijze gelijkaardig aan die van INSTIs, echter met enkele unieke kenmerken. Onze karakterisatie suggereert dat MB-76 een veelbelovende kandidaat is voor verdere ontwikkeling.

Hoofdstukken 4 en 5 beschrijven een volledig andere benadering van IN als doelwit. HIV-1 is in staat om niet-delende cellen te infecteren en moet dus eerst geïmporteerd worden in de nucleus alvorens integratie kan plaatsvinden. Transportine-SR2 (TRN-SR2) is een cellulair β-karyoferine dat het virale preïntegratiecomplex (PIC) zou importeren in de nucleus door middel van een rechtstreekse binding aan IN. Zoals bij de meeste cellulaire cargo’s wordt de energie voor nucleaire import geleverd door een gradiënt van de GTP- en GDP-gebonden vormen van Ran, een klein GTPase. Hoofdstuk 4 is een biochemische en structurele karakterisatie van de interactie tussen TRN-SR2 en Ran. We tonen dat stabiele TRN-SR2–RanGTP complexen gevormd worden in oplossing. Zoals bij cellulaire importcargo’s komt ook IN los van TRN-SR2 dankzij RanGTP. Terwijl bij hoge concentraties TRN-SR2 de neiging heeft omte dimeriseren, zorgt toevoeging van RanGTP voor een compact complex. We stellen een homologiemodel van het TRN-SR2–RanGTP complex voor dat overeenkomt met de experimentele data afkomstig van kleine-hoekverstrooiingvan röntgenstraling. Dit model brengt ons een stap dichter bij het inhiberen van TRN-SR2 voor therapeutische doeleinden. In hoofdstuk 5 rapporteren we de ontwikkeling van een proces voor de hoge-doorvoerscreening van kleine inhibitorische moleculen van de interactie tussen HIV-1 integrase en TRN-SR2, die de virale nucleaire import en replicatie blokkeren. Uit een bibliotheek van 25608 moleculen identificeren we 5 actieve families. Voor alle 5 klassen detecteerden we een bescheiden antivirale activiteit. Twee representatieve moleculen reduceerden het percentage nucleaire PICs in een op fluorescentie gebaseerde HIV-1 nucleaire importtest. Deze moleculen zijn de eerste kleine inhibitoren van HIV-1 nucleaire import en bevestigen de rol van de IN–TRN-SR2-interactie tijdens deze stap.

Aangezien IN minstens een dynamisch evenwicht tussen dimeren en tetrameren vereist voor zijn katalytische activiteiten, is een ander therapeutisch doelwit IN-oligomerisatie. In hoofdstuk 6 ontwikkelen, karakteriseren en valideren we een op AlphaScreen gebaseerde test voor de hoge-doorvoerscreening van modulatoren van HIV-1 IN-dimerisatie. Moleculen diegeïdentificeerd worden als hits zijn allosterische IN inhibitorendie niet kruisresistent zijn met INSTIs en dus een echte nieuwe generatie IN-inhibitor kunnen worden. Bovendien biedt de test een platform voorde studie van IN dimerisatie en voor het ontrafelen van het werkingsmechanisme van LEDGINs, allosterische inhibitoren die de Lens epithelium-derived growth factor/p75 (LEDGF/p75) bindingsplaats op HIV-1 IN herkennen.

In hoofdstuk 7 ten slotte, identificeren we de aminozuren in HIV-1 IN die rechtstreeks interageren met basen van het doelwit-DNA en alzo selectie van de lokale integratieplaats tijdens virale replicatie beïnvloeden. Deze residuen bepalen ook de neiging van het virus om te integreren in flexibele doelwit-DNA-sequenties. Opmerkelijk is dat de natuurlijke polymorfismen INS119G en INR231G virale integratie wegleiden uit genrijke regios. Precies deze varianten zijn geassocieerd met snellere progressie van de ziekte in een cohort chronisch geïnfecteerde HIV-1 subtypeC patiënten. Deze bevindingen linken integratieplaatsselectie met virulentie en virale evolutie maar ook met de imuunrespons en antiretroviraletherapie aangezien HIV-1 IN119 onder selectiedruk staat van HLA-allelenen INSTIs.