< Terug naar vorige pagina

Project

Oppervlaktemodificatie van op plantenproteïne gebaseerde nanodeeltjes: Een hulpmiddel om hun functionele eigenschappen te verbeteren

De belangstelling voor het vervangen van dierlijke door plantaardige proteïnen in voedselsystemen stijgt. Dergelijke vervanging is echter om verschillende redenen niet eenvoudig. Een belangrijk obstakel is de vaak beperkte oplosbaarheid van plantaardige proteïnen in waterige media, waardoor hun toepasbaarheid in heel wat levensmiddelen sterk afneemt. Een mogelijke oplossing is de productie van proteïne nanopartikels (NPs) die colloïdaal stabiel zijn in waterige systemen. Het oplosbaarheidsprofiel van prolaminen uit granen (zoals gliadine uit tarwe en zeïne uit maïs) maakt het mogelijk om zulke NPs (respectievelijk GNPs en ZNPs) te maken via vloeibare antisolvent-precipitatie (LAS). In een dergelijke procedure wordt op een gecontroleerde manier proteïne-aggregatie geïnduceerd door een afname van de kwaliteit van het oplosmiddel, om zo homogene waterige NP dispersies te bekomen.

GNPs en ZNPs zijn potentiële nieuwe voedselingrediënten voor o.a. encapsulatietoepassingen of de stabilisatie van voedingsemulsies en -schuimen. Het vermogen van GNPs en ZNPs om schuim te stabiliseren is tot hiertoe slechts in beperkte mate onderzocht. Het is echter bekend dat schuim gevormd door GNPs een goede stabiliteit heeft in een beperkt pH-bereik. ZNPs daarentegen hebben zeer beperkte schuimeigenschappen ongeacht de pH. Bovendien zijn de mechanismen die aan de grondslag liggen van de schuimeigenschappen van dergelijke NPs nog steeds slecht begrepen. Tot slot hebben dergelijke NPs slechts een beperkte colloïdale stabiliteit onder omstandigheden die relevant zijn voor voedingssystemen. Dit beperkt de potentiële toepassing van GNPs/ZNPs in voedingssystemen.

In deze context had dit proefschrift een tweeledig doel. Een eerste doelstelling was het optimaliseren van de productie van functionele graanprolamine-gebaseerde NPs (op basis van gliadine, zeïne, of mengsels daarvan) met goede schuimeigenschappen en hoge colloïdale stabiliteit onder omstandigheden relevant voor voedingssystemen. Een tweede doel was het ontrafelen van de mechanismen die de schuimeigenschappen van zulke NPs onderbouwen, en dus hun structuur-functie relatie.

Eerst werden NPs op basis van gliadine, commercieel zeïne en zeïne geëxtraheerd uit maïsmeel op laboratoriumschaal (respectievelijk GNPs, CS-ZNPs en LS-ZNPs) geproduceerd via een geoptimaliseerde LAS-procedure en werden hun schuimeigenschappen onderzocht over een breed pH-bereik (4.0 tot 10.0). Meer specifiek werd het vermogen van de NPs om schuim te vormen (gedefinieerd als schuimcapaciteit; FC) en om het geproduceerde schuim in de loop van de tijd te stabiliseren (gedefinieerd als schuimstabiliteit; FS) onderzocht.

De FC van CS-ZNPs was zeer laag ongeacht de pH (4.0 – 10.0), terwijl de FC van LS-ZNPs pH-afhankelijk was en relatief laag bij pH-waarden tussen 4.0 en 8.0. Bij pH 10.0 kon echter een aanzienlijke hoeveelheid schuim worden gevormd met deze laatste NPs. GNPs daarentegen hadden een goede FC ongeacht de pH-waarde. FC van proteïnen of daarop gebaseerde NPs wordt vaak in verband gebracht met de snelheid waarmee ze adsorberen op de lucht-water (A-W) interfase, wat op zijn beurt in verband kan worden gebracht met hun grootte, oppervlaktelading en oppervlaktehydro-fobiciteit. Er waren echter geen duidelijke correlaties tussen de adsorptiesnelheid van de verschil-lende NPs en de FCs die ze veroorzaakten. Er werd een bijkomend mechanisme verondersteld, waarbij de FC van CS-/LS-ZNPs negatief beïnvloed wordt via een overbruggend “de-wetting” effect. Dit kan coalescentie van aangrenzende luchtbellen veroorzaken. Omdat dit niet werd waargenomen bij GNPs, die een vaste deeltjesachtige structuur hadden, wordt verondersteld dat de coacervaat-achtige morfologie van CS-/LS-ZNPs een rol speelt in hun antischuimeffect. Dit moet echter verder worden onderzocht.

Er kon bijna geen schuim worden geproduceerd uit CS-ZNP suspensies. Het vermogen van CS-ZNP om schuim te stabiliseren werd dus niet verder onderzocht. FS veroorzaakt door LS-ZNPs was pH-afhankelijk en nam toe met de pH. Bij pH 4.0 vormden LS-ZNPs coherente films op de A-W interfase (zoals aangegeven door interfasedilatatie reologiemetingen) en werd slechts beperkte FS geobserveerd. Bij pH 8.0 en 10.0 stabiliseerden LS-ZNPs het schuim effectiever, ook al vertoonden de gevormde interfasefilms bij deze pH-waarden slechts een beperkte viscoelasticiteit. Dit suggereerde dat de vorming van interfasefilms niet het belangrijkste mechanisme was aan de grondslag van de FS van LS-ZNPs. Er werd verondersteld dat de goede FS veroorzaakt door LS-ZNPs bij hogere pH gerelateerd was aan elektrostatische en sterische effecten tussen interfases van aangrenzende luchtbellen. Polaire lipiden aanwezig in het gebruikte zeïnepoeder kunnen ook hebben bijgedragen aan FS. Het “de-wetting” effect bij het dunner worden van de vloeistoffilm tijdens schuimdrainage kan ook hebben bijgedragen aan de lagere FS. Dit fenomeen was meer waarschijnlijk bij pH 4.0 zoals ondersteund door schuimfractionatie-experimenten, waarin werd aangetoond dat meer NP materiaal aanwezig was in de schuimfase en dus in de dunne vloeibare films bij pH 4,0 dan bij hogere pH. De mate waarin FS werd veroorzaakt door GNPs was ook pH-afhankelijk, maar er werden duidelijk andere trends waargenomen dan voor LS-ZNPs. De beste FS werd voor GNP suspensies waargenomen bij pH 6.0 en 8.0, d.w.z. dicht bij het iso-elektrisch punt (pI) van gliadinen. Dit werd verklaard door sterke onderlinge interacties van gliadinen (NP) bij hun adsorptie aan de A-W interfase en dus bij de vorming van coherente films. Bij pH-waarden verder verwijderd van het gliadine-pI werd de mate van interfasefilmvorming beperkt door afstotende elektrostatische effecten tussen geadsorbeerde proteïnen (NP-bestanddelen), wat resulteerde in een lage FS.

Vervolgens werd verondersteld dat co-precipitatie van proteïnen met verschillende mechanismen van schuimstabilisatie kan resulteren in NPs met verbeterde schuimeigenschappen. Qua schuim-eigenschappen hadden hybride NPs op basis van zowel gliadine en LS-zeïne (GZNPs) allemaal een FC die vergelijkbaar was met die van GNPs, ongeacht de gliadine/zeïne-verhouding die tijdens de productie werd gebruikt. Gliadine bepaalde dus in grote mate de FC van GZNPs. De FS van GZNPs leek daarentegen veroorzaakt te worden door beide proteïnetypes, aangezien er waarden werden waargenomen die tussen die van GNPs en LS-ZNPs in lagen. Goede FS veroorzaakt door GZNPs (vergelijkbaar was met die van GNPs) werd opgemerkt bij pH 8.0 en 10.0, ondanks de beperkte samenhang van de gevormde interfasefilms bij deze pH-waarden. Zo werd de goede FS teweeggebracht door GZNPs toegeschreven aan (beperkte) interfasefilmvorming, elektrostatische effecten en de bijdrage van endogene lipiden aanwezig in het systeem. Bij pH 4.0 nam de FS die door GZNPs werd bewerkstelligd toe als er minder gliadine werd gebruikt tijdens hun productie, wat verband hield met een hogere coherentie van de gevormde interfasefilm.

Het is de moeite waard om te vermelden dat de FS van alle bovengenoemde NP soorten nog steeds relatief beperkt was bij pH 4.0 en dat verdere verbetering daarom nog gewenst waren. Een modificatiestrategie van GNPs op basis van hun incubatie met het proteïneverknopingsenzym transglutaminase (TG) werd daarom onderzocht. Terwijl TG-behandeling geen noemenswaardige invloed had op de FC van GNPs, beïnvloedde het de FS bij pH 4.5 wel positief. Dit effect was deels gekoppeld aan een versterking van de interfaseproteïnefilms door TG-gekatalyseerde vorming van (iso)peptidebindingen tussen GNP bestanddelen, en deels aan de opname van lysineresidues in de nieuw gevormde bindingen die anders een positieve lading zouden hebben. Dit laatste effect vergemakkelijkte wellicht GNP (bestanddeel) interacties op de interfase. Bij pH 9.0, d.w.z. onder omstandigheden waarbij niet gemodificeerde GNPs goede FS veroorzaakten, werd geen noemenswaardige invloed van TG op de functionaliteit van GNPs waargenomen.

Om de bijdragen van elektrostatische effecten aan de interfase en schuimeigenschappen van NPs op basis van gliadine beter te begrijpen, werd in een aangepaste LAS-procedure een co-precipitatie uitgevoerd met chitosan, een polysacharide bestaande uit glucosamine-eenheden, wat resulteerde in de vorming van gliadine-chitosan NPs (GCNPs). Bij pH 4.5, oftewel bij een pH waar de vrije aminogroepen van gliadine en chitosan werden geprotoneerd, was de FS van dergelijke GCNP’s echter zeer laag. Er werd dus geconcludeerd dat chitosan niet positief bijdroeg aan FS, en dit door het verhogen van de elektrostatische afstoting en sterische hinder tussen aangrenzende gascellen. Bovendien verzwakte de aanwezigheid van geladen groepen afkomstig van chitosan aan de interfase de gevormde film door het beperken van proteïne-proteïne interacties aan de interfase, wat uiteindelijk leidde tot lage FS.

Interessant is dat GCNPs weliswaar beperkte schuimeigenschappen hadden, maar wel een uitstekende colloïdale stabiliteit. Bij pH 4.0 waren gewone GNPs tot 10 dagen stabiel, maar bij pH 6.0 sloegen ze snel neer. GCNPs bleven echter stabiel gedurende 17 dagen bewaring bij beide pH-waarden. Bovendien sloegen gewone GNPs zeer snel neer bij NaCl-concentraties van slechts 0.02 M, terwijl GCNPs stabiel bleven tot 1.5 M NaCl. Een dergelijke uitstekende stabiliteit in aanwezigheid van zout werd, voor zover deze auteur weet, niet eerder gerapporteerd voor vergelijkbare (on)gemodificeerde NPs op basis van gliadines.

Concluderend kan gesteld worden dat het werk in dit proefschrift geleid heeft tot een beter begrip van de mechanismen die aan de grondslag liggen van de schuimeigenschappen van graanprolamine-gebaseerde NPs. Bovendien werd een modificatiestrategie van GNPs ontwikkeld waarbij TG werd gebruikt. Het gebruik van het enzym verbeterde hun schuimeigenschappen bij pH 4,5. In vervolgonderzoek moeten de schuimeigenschappen van dergelijke (met TG gemodificeerde) GNPs in complexere matrices die echte voedselsystemen weerspiegelen, worden onderzocht. GCNPs hebben, ondanks hun slechte schuimeigenschappen, een groot potentieel in toepassingen waarvoor een hoge colloïdale stabiliteit noodzakelijk is, bijvoorbeeld bij de inkapseling van bioactieve componenten. Maar verder onderzoek in deze context is natuurlijk vereist.

Datum:16 okt 2018 →  18 dec 2023
Trefwoorden:protein nanoparticles
Disciplines:Microbiologie, Systeembiologie, Laboratoriumgeneeskunde, Engineering van biomaterialen, Biologische systeemtechnologie, Biomateriaal engineering, Biomechanische ingenieurswetenschappen, Andere (bio)medische ingenieurswetenschappen, Milieu ingenieurswetenschappen en biotechnologie, Industriële biotechnologie, Andere biotechnologie, bio-en biosysteem ingenieurswetenschappen, Andere chemie, Voeding en dieetkunde, Productie van landbouwdieren, Levensmiddelenwetenschappen en (bio)technologie
Project type:PhD project