Rol van connexines en pannexines in geprogrammeerde celdood.

Cx en Panx delen structurele gelijkenissen, maar ze behoren tot verschillende eiwitfamilies. Dit project stelt een in vitro onderzoek voor van de specifieke eigenschappen van deze proteïnen en hun rol in het ontstaan en de intercellulaire voortgeleiding van celdood. We willen een experimenteel cel-model ontwikkelen om de relatie tussen IC en celdood te bestuderen. De volgende punten zullen behandeld worden: i) Rol van GJ in de verspreiding van celdood signalen, met focus op de rol van calcium en IP3. ii) Evaluatie van het respectievelijk belang van HC en van GJ/HC-onafhankelijke paden. iii) Panx-1 HC in intracellulaire membranen en controle van de hoeveelheid calcium in het ER. We zullen verschillende cellulaire modelsystemen gebruiken, meer bepaald celtypes met gedocumenteerde expressie van specifieke Cx isovormen, zoals CPAE calf pulmonary artery endothelial cells (Cx43, Cx40, Cx37), RPE retinal pigment epithelial cells (Cx37, Cx43, Cx45) en LLCPK1 renal kidnay cells (Cx32). Experimentele manipulatie (knock-down) van endogene Cx of Panx zal gebeuren gebruik makend van siRNA technologie. Als alternatief zullen we stabiele cellijnen gebruiken, die we willen verkrijgen door in GJ-loze cellen (vb. verscheidene tumor cellijnen zoals HeLa cervicale kankercellen, C6 glioma cellen, LNCaP prostaat kankercellen) de relevante Cx of Panx cDNA te transfecteren (knock-in). We zullen eveneens deze GJ-loze cellen infecteren met recombinant adenovirussen (Invitrogen) die de relevante Cx isovormen of Panx-1 bevatten. De expressie van cx of Panx zullen we evalueren met Western blotting en immunofluorescentie, gebruik makend van commercieel verkrijgbere antilichamen of van antilichamen tegen expressie merkers (vb. Haemo-agglutinine, cMyc, FLAG). Om in gemarkeerde cellen te induceren zullen we een bicistronische vector met constitutief tot expressie gebracht Cherry fluorescent proteïne samen met de gereguleerde expressie (Tet-on/Tet-off) van ofwel het pro-apoptotische Bax of het BH3-only proteïne Bim, wat onmiddellijk upstream van Bax ligt, ontwikkelen. De verspreiding van apoptose in de cel monolaag zal dan bestudeerd worden met behulp van fluorescente merkers zoals FITC-annexine V en propidium jodide voor secondaire necrose. 
IC wordt gekarakteriseerd door meting van het actief oppervlak van de voortplanting van de calciumgolven en van het celdood signaal, van de genormaliseerde fluorescentie intensiteit, en van het percentage responsieve naburige cellen bij inductie van apoptose. De calciumgolf zal gevisualiseerd worden via confocale microscopie (Zeiss LSM-510), gebruik makend van de calciumgevoelige fluorescente indicator Fluo4-AM, en geëvalueerd worden met LSM-510 software. Voor de studie van GJIC wordt gebruik gemaakt van de kwantitatieve FRAP-methode (Fluorescence Recovery After photobleaching) (21-23), en van scrape-loading experimenten (23). Om de rol van Cx en Panx in HC-gemedieerde IC te onderzoeken maken we gebruik van Lucifer Yellow dye-uptake experimenten en meten we de ATP-vrijzetting via de luciferine-luciferase techniek. Bulk ATP metingen zullen gebeuren met een foton counting fotomultiplier met zeer hoge gevoeligheid (H7360-01; Hamamatsu Photonics Japan). Om een mogelijke rol van Cx en/of Panx die niet gemedieerd is via IC te bestuderen, zullen we de IC inhiberen (vb. famacologisch) in cellen waarin Cx/Panx tot overexpressie gebracht werden.

Trefwoorden:Apoptosis, Intracellular communication, Connexins, Calcium, Pannexins

Disciplines:Fysiologie