< Terug naar vorige pagina

Project

Super resolutie fluorescentie microscopie van biomoleculaire interacties met fotochrome biosensoren en complementatie.

Fluorescentiemicroscopietechnieken zijn essentiële onderzoeksmethodes die het mogelijk hebben gemaakt om levende cellen te visualiseren met een lage invasiviteit, hoge gevoeligheid en hoge spatiotemporele resolutie. Fluorescentiemicroscopie heeft bijgevolg voor een revolutie gezorgd in ons begrip van de innerlijke werking van zowel individuele cellen als volledige organismen. De fluorescente labels vormen een integraal onderdeel van de beeldvorming in fluorescentiemicroscopie, want de kwaliteit van deze labels beïnvloedt de kwaliteit van de data. Onderzoekers hebben daarom door de jaren heen gefocust op de ontwikkeling van nieuwe en verbeterde fluoroforen. Dit geldt ook voor fluorescerende proteïnen (FP’s), de genetisch gecodeerde labels die zeer specifieke targeting, labeling en tracking in levende cellen mogelijk maken.

De zogenoemde toolbox van beschikbare FP’s is de afgelopen 25 jaar aanzienlijk uitgebreid, enerzijds door de ontdekking van nieuwe FP-varianten in verschillende mariene organismen, anderzijds door protein engineering van bestaande FP’s. Een fascinerende toevoeging aan deze toolbox zijn de fototransformeerbare FP’s. Deze fotofysisch “slimme” FP-varianten kunnen een licht-geïnduceerde transformatie ondergaan die hun spectrale eigenschappen verandert. Ze worden daarom vaak gebruikt voor geavanceerde microscopietechnieken, zoals superresolutie-fluorescentiemicroscopie of single particle tracking. Een voorbeeld van fototransformeerbare FP’s zijn de reversibel schakelbare of fotochrome FP’s. Een tweede indrukwekkende prestatie van de FP-technologie is de ontwikkeling van fluorescente biosensoren op basis van FP’s. Een biosensor is gevoelig voor een specifieke, biologische stimulus - zoals enzymatische activiteit of veranderende ionconcentraties - en als reactie op die stimulus veranderen de fluorescente eigenschappen van de sensor. Zulke biosensoren maken dus de dynamische observatie mogelijk van processen zoals ze plaatsvinden in de levende cel. Een zeer succesvol voorbeeld hiervan is de visualisatie van calcium (Ca2+) signalering. Maar de combinatie van fotofysisch “slimme” FP’s en biosensoren is een domein dat nieuwe mogelijkheden biedt voor superresolutie-microscopie, optical highlighting en ratiometric imaging.

Het werk dat hier wordt gepresenteerd beschrijft de ontwikkeling van nieuwe en verbeterde genetisch gecodeerde, fluorescente reporters met extra functionaliteit. Centraal in dit werk staat de ontwikkeling van reversibel schakelbare, genetisch gecodeerde calcium-indicatoren (Eng.: rsGECIs) via de combinatie van twee concepten van FP-technologie: het fotochromisme dat men kan terugvinden in reversibel schakelbare FP’s (RSFP’s) en de FP-gebaseerde calcium-indicatoren die gebruikt worden om veranderingen in calciumconcentraties te visualiseren.

In het eerste hoofdstuk zal ik de context van dit onderzoek voorstellen en de belangrijkste concepten en technieken introduceren. De volgende twee hoofdstukken focussen op mijn bijdrage aan de verbetering van gekende FP’s met het oog op hun toepassing in superresolutie-fluorescentiemicroscopie. In Hoofdstuk 2 zal ik focussen op de gerichte evolutie van rsEGFP en beschrijf ik de ontwikkeling en de karakterisatie van een familie van rsEGFP-varianten met een verbeterde eiwitvouwing. Vervolgens worden deze varianten, de rsGreens, toegepast in superresolutie-microscopietechnieken zoals pcSOFI en RESOLFT. In Hoofdstuk 3 beschrijf ik hoe het niet-fototransformeerbare, rode FP mCherry gebruikt kan worden in single-molecule localization microscopie via een chemisch-geïnduceerde, blauw-fluorescente toestand.

Hoofdstuk 4 beschrijft de eerste strategie die ik gebruikt heb om rsGECIs te creëren. Ik koos Dronpa en rsGreen0.7 (beiden RSFPs) als startpunt o.w.v. hun uitstekende fotochromisme en produceerde een reeks van structurele varianten. Vervolgens integreerde ik deze structurele varianten in een GCaMP backbone. Deze strategie resulteerde uiteindelijk niet in functionele probes.

Hoofdstuk 5 beschrijft de ontwikkeling van nieuwe rsGECIs via een tweede strategie. Deze keer startte ik van de GCaMP-familie van calcium-indicatoren en verbeterde het fotochromisme via gerichte mutagenese. Dit resulteerde in de identificatie van een innovatieve, fotochrome GCaMP-mutant die ik gebruikte om veranderende calciumconcentraties in levende cellen te bepalen. Hiervoor ontwikkelden we ook een geavanceerd visualisatieschema waarbij we gebruik maakten van de calciumafhankelijke fototransformatie van de nieuwe, fluorescente indicator. Dit wordt gevolgd door het laatste hoofdstuk waar ik de conclusies van deze dissertatie geef en enkele perspectieven presenteer.

.

Datum:1 okt 2013 →  15 jul 2021
Trefwoorden:Fluorescentie microscopie
Disciplines:Fysische chemie, Duurzame chemie, Anorganische chemie, Organische chemie, Theoretische en computationele chemie, Andere chemie
Project type:PhD project