Validatie van nieuwe cellulaire cofactoren voor retrovirale, nucleaire import en integratie van retrovirussen.

Efficiënte replicatie van het humane immunodeficiëntievirus type-1 (HIV-1) is afhankelijk van de aanwezigheid van specifieke eiwitten in de geïnfecteerde cel, de zogenaamde cofactoren. Sommige interacties zijn essentieel voor het virus en vormen bijgevolg interessante doelwitten voor geneesmiddelenontwikkeling. In dit werk focussen we op de validatie en karakterisatie van virus-gastheerinteracties van het virale integrase-eiwit en onderzoeken we het werkingsmechanisme van moleculen die deze interacties verbreken.

In 2003 valideerde onze groep het eiwit LEDGF/p75 als een cofactor van HIV-integrase. Door de interactie met LEDGF/p75 integreert het virus preferentieel in actief chromatine. Bovendien simuleert LEDGF/p75 de katalytische activiteit van integrase. Deze ontdekking leidde tot de ontwikkeling van LEDGINs in 2010, kleine moleculen die binden aan de LEDGF/p75-bindingsplaats op HIV-integrase. LEDGINs verbreken de binding tussen LEDGF/p75 en HIV-integrase en werken als allosterische inhibitoren van HIV‑integrase. Momenteel zijn de eerste moleculen in vroege klinische ontwikkeling. LEDGINs verhinderen echter niet enkel de integratiestap, maar beïnvloeden ook latere stappen in de HIV-replicatiecyclus. Om het mechanisme dat verantwoordelijk is voor dit late effect te achterhalen, onderzochten we twee hypotheses: 1.) Het late effect van LEDGINs wordt gemedieerd door hun effect op de multimerisatie van het integrase-eiwit, of van het Pol-voorlopereiwit in het virion. 2.) Het late effect van LEDGINs wordt gemedieerd doordat deze moleculen LEDGF/p75 verdringen uit zijn bindingsplaats op HIV-integrase in virale partikels, wat impliceert dat LEDGF/p75 een functie heeft tijdens de late stappen van de replicatiecyclus.

In hoofdstuk 3 bestuderen we de eerste hypothese. We tonen aan dat LEDGINs de late stadia van HIV-replicatie sterk inhiberen, met halfmaximale effectieve concentraties (EC50’s) in het nanomolair bereik. Verder tonen we aan dat de toevoeging van LEDGINs gedurende virusproductie leidt tot de vorming van defectieve virussen met een nucleoproteïnecomplex dat buiten de capsidekegel ligt. De oorzaak hiervan is een afwijkende multimerisatie van het integrase-eiwit, of het Pol-voorlopereiwit.

In hoofdstuk 4 onderzoeken we de tweede hypothese. Hoewel depletie van LEDGF/p75 in virusproducerende cellen niet leidt tot veranderingen in de potentie van LEDGINs, tonen we aan dat LEDGF/p75 gerecruteerd wordt in viruspartikels door een directe interactie met het virale integrase, of zijn voorlopervorm Pol. Daarenboven beschrijven we dat LEDGF/p75 een substraat is voor het HIV-1-protease. Een mogelijk functie van LEDGF/p75 in het viruspartikel konden we echter niet achterhalen.

In hoofdstuk 5 valideerden en krakteriseerden we de rol van het cellulaire eiwit YB-1 (Y‑box‑binding protein 1) als een cofactor van HIV-replicatie. Depletie van YB-1 resulteerde in sterk verminderde virale replicatie in verschillende cellijnen. Depletie van YB-1 leidde tot een gedaalde productie van nieuwe viruspartikels door interferentie met het virale RNA metabolisme. Door middel van kwantitatieve PCR en een microscopiegebaseerde nucleaire-importtest konden we eveneens aantonen dat de vroege stappen van de virale replicatie aangetast worden op een moment dat zich bevindt tussen de reverse transcriptie en de nucleaire import. Door middel van co-immunoprecipitatie en Western-blotanalyse konden we aantonen dat YB-1 interageert met HIV-integrase. Een directe interactie tussen YB-1 en HIV-integrase konden we echter niet demonstreren door aspecifieke binding van YB-1 aan andere eiwitten. Deze resultaten tonen aan dat YB-1 belangrijk is voor meerdere stappen in de virale replicatiecyclus.

Samengevat, werd in deze thesis dieper ingegaan op virusgastheerinteracties door het ontrafelen van het werkingsmechanisme van LEDGINs, het aantonen van de aanwezigheid van LEDGF/p75 in viruspartikels en het karateriseren van YB-1 als een cofactor van HIV-1-replicatie.