Functional analysis and development of inhibitors of Staphylococcus epidermidis type I signal peptidases

De medische wereld ondervindt steeds meer problemen voor de behandeling van bacteriële infecties door het groeiend aantal multi-resistente bacte riën. Daarom is er een grote nood aan nieuwe klassen van antibacte riële middelen met een nieuw werkingsmechanisme om kruisresistentie met bestaande antibiotica te vermijden. Daarenboven vertonen bacteriën in een biofilm een verminderde antibioticagevoeligheid met als gevolg d at biofilm-gebaseerde infecties, zoals vreemdlichaam-geassocieerde infec ties, moeilijk effectief te behandelen zijn. Met dit project werd getracht een nieuwe klasse antibacteriële middelen te ontwikkelen, gericht tegen het bacteriële type I signaalpeptidase (SP ase I). Het bacteriële SPase I is een serine endopeptidase veranke rd in de cytoplasmamembraan en speelt een essentiële rol in eiwitsecreti e aangezien het verantwoordelijk is voor de katalytische afsplitsing van signaalpeptiden van secretorische eiwitten tijdens of kort na hun doorg ang doorheen de cytoplasmamembraan. De combinatie van het universe el en essentieel karakter van het doelwit, de gemakkelijke toegankelijkh eid van de actieve plaats aan de buitenkant van de cytoplasmamembraan en de mogelijkheid tot selectieve inhibitie van bacteriële enzymen, maakt van het SPase I een interessant doelwit voor de ontwikkeling van antibac teriële middelen met een nieuw werkingsmechanisme. Het doel van dit project was dan ook de functionele analyse van de SPase s I van Staphylococcus epidermidis en het verder onderzoeken van deze SP ases I als antibacterieel doelwit in biofilm-geassocieerde bacteriën in onze zoektocht naar potente SPase I inhibitoren. De opportunistisc he pathogeen S. epidermidis wordt meer en meer resistent tegen de gebrui kelijke antibacteriële behandelingswijzen en kan daarom een belangrijke bron vormen van levensbedreigende infecties geassocieerd met implantaten en biofilmen. De meeste bacteriën hebben één SPase I voor he t processen van alle secretorische eiwitten. Het genoom van S. epi dermidis bevat echter drie SPase I coderende genen, namelijk sip1, sip2 en sip3. Sip2 en sip3 coderen voor functionele SPases I terwi jl Sip1 de essentiële katalytische Lys ontbreekt en daarom verondersteld wordt inactief te zijn. Allereerst werd het SPase I onderzocht als doelwit voor biofilm-gebaseer de infecties. Genexpressiestudies toonden een initiële toename in expressie van de S. epidermidis sip genen in planktonische en in sessiel e bacteriën en duidden op een meer uitgesproken expressie in sessiele ba cteriën. Bovendien leidde de behandeling van S. epidermidis biofilmen met de gekende lipohexapeptide SPase I inhibitor arylomycine A 2 tot een antibacterieel effect vergelijkbaar met rifampicine. Ten slotte kon activiteit van het SPase I-afhankelijk gesecreteerde eiwit&nb sp;ß-lactamase aangetoond worden in het cultuurmedium van biofilm-g eassocieerde S. epidermidis cellen. Dit bevestigt de in vivo funct ionele activiteit van SPases I in S. epidermidis biofilmen. In een tweede deel werden twee in vitro testsystemen ontwikkeld om de fu nctionele activiteit van de opgezuiverde SPases I te onderzoeken en om d e activiteit van mogelijke SPase I inhibitoren te evalueren. In he t eerste testsysteem werd het processen van een natuurlijk preproteïnesu bstraat geanalyseerd, terwijl in het tweede testsysteem het splitsen van een fluorescerend synthetisch peptide gebaseerd op de sequentie van dit natuurlijke substraat werd gemeten. Met behulp van beide testsyst emen werd in vitro functionele activiteit van de opgezuiverde S. epiderm idis Sip2 en Sip3 enzymen aangetoond, terwijl Sip1 inderdaad inactief bleek te zijn. We toonden verder aan dat de laatstvermeld e FRET-gebaseerde test een snelle en gemakkelijke methode is om kwantita tieve informatie te verkrijgen over de activiteit van SPase I inhibitore n, terwijl de meer uitgebreide preproteïnetest kan dienen om de activite it van SPase I inhibitoren verder te bevestigen. Tenslotte werden peptidomimetica SPase I inhibitoren op een rationele ma nier ontwikkeld. Een substraat-gebaseerd peptide aldehyde, decanoy l-PTANA-aldehyde, inhibeerde S. epidermidis Sip2 en Sip3, S. aureus SpsB en E. coli LepB in vitro, maar vertoonde de beste activiteit tegen S. a ureus SpsB met een IC50 waarde van 0.09 µM. Deze inhibitor wa s echter maar matig antibacterieel actief in vivo. Combinatie van het peptide aldehyde met amoxicilline leidde wel tot een sterke verlagin g van de MIC van amoxicilline tegen een MRSA stam. Deze bevinding ondersteunt het idee om SPase I inhibitoren te gebruiken in combinatie m et ß-lactam antibiotica om de secretie van ß-lactama se te blokkeren en op deze manier ß-lactamase secreterende res istente stammen opnieuw gevoelig te maken. We kunnen dus concluderen dat we in dit werk aangetoond hebben dat, onda nks de lage metabolische activiteit van bacteriën in een biofilm, het ba cteriële SPase I ook van essentieel belang is voor deze bacteriën, waard oor het een veelbelovend doelwit is voor het ontwikkelen van antibacteri ële middelen tegen biofilm-gebaseerde infecties. Bovendien hebben we twee in vitro testsystemen op punt gesteld en hebben we aangetoond da t de FRET-gebaseerde test een waardevolle methode is om SPase I inhibito ren te identificeren en te valideren. Een substraat-gebaseerd pept ide aldehyde met goede in vitro inhibitorische activiteit werd ontwikkel d, maar deze verbinding was matig antibacterieel actief in vivo. D eze resultaten tonen het belang aan van verder onderzoek om meer potente SPase I inhibitoren te ontwikkelen als antibacteriële middelen en als t herapie voor vreemdlichaam-geassocieerde infecties.

Jaar van publicatie:2009

Toegankelijkheid:Closed